تقييم ميكانيكا الجهاز التنفسي في الفئران باستخدام تقنية التذبذب القسري
Summary
يوفر هذا البروتوكول وصفا خطوة بخطوة مفصل للإجراءات المطلوبة لتنفيذ القياسات الميكانيكا الجهاز التنفسي وكذلك تقييم استجابة مجرى الهواء المستنشق إلى ميثاكولين في الفئران باستخدام تقنية التذبذب القسري (flexiVent؛ SCIREQ المؤتمر الوطني العراقي، مونتريال، QC ، كندا).
Abstract
أسلوب التذبذب القسري (FOT) هي قوية وأداة تكاملية ومتعدية السماح بتقييم التجريبية من وظيفة الرئة في الفئران في مفصل، بطريقة شاملة ودقيقة وقابلة للتكرار. أنها توفر قياسات الميكانيكا الجهاز التنفسي من خلال تحليل الضغط وحجم الإشارات المكتسبة في رد فعل على معرفة مسبقا، والسعة الصغيرة، متذبذبة تدفق الهواء الطول الموجي، والتي يتم تطبيقها عادة في هذا الموضوع في مجرى الهواء الافتتاح. تفاصيل البروتوكول الخطوات المطلوبة لتنفيذ القياسات على نحو كاف التذبذب القسري في الفئران باستخدام جهاز التنفس الصناعي مكبس الكمبيوتر التي تسيطر عليها (flexiVent؛ SCIREQ المؤتمر الوطني العراقي، مونتريال، QC، كندا). وينقسم إلى أربعة أجزاء الوصف: الخطوات التحضيرية، والتهوية الميكانيكية، وقياسات وظائف الرئة، وتحليل البيانات. وهو يتضمن أيضا تفاصيل عن كيفية تقييم استجابة مجرى الهواء المستنشق إلى ميثاكولين في تخدير الفئران، تطبيق شيوعا لهذا التقنيهه الذي يمتد أيضا إلى النتائج الأخرى ومختلف الأمراض الرئة. يتم عرض القياسات التي تم الحصول عليها في الفئران السذاجة وكذلك من نموذج يحركها من الإجهاد التأكسدي الضرر مجرى الهواء لتوضيح كيفية هذه الأداة يمكن أن تسهم في توصيف وفهم التغيرات الفسيولوجية درس أو نماذج المرض بشكل أفضل وكذلك للتطبيقات في مجالات بحثية جديدة.
Introduction
أصبح توصيف كاف من الخواص الميكانيكية للالرئتين في الحيوانات الصغيرة الأساسية منذ المزدهرة في نماذج الفئران في علم الجهاز التنفسي. عندما أجريت باستخدام تقنية التذبذب القسري (FOT)، وهي تقنية تستخدم أيضا في البشر، هذه القياسات توفير نهج قوي، تكاملية ومتعدية لدراسة التغيرات الفسيولوجية ذات مغزى. وعادة ما يتم الحصول على قياسات FOT من خلال تحليل الضغط وحجم الإشارات المكتسبة في رد فعل على معرفة مسبقا، والسعة الصغيرة، متذبذبة تدفق الهواء الموجي (ويشار إلى اضطراب أو إشارة المدخلات أيضا) المطبقة في هذا الموضوع في مجرى الهواء الافتتاح 1. في أبسط أشكالها، فإن اضطراب FOT يكون الموجي الجيبية واحد على تردد محددة جيدا. تتكون اضطرابات أكثر تعقيدا عادة من تراكب مجموعة مختارة من معين (رئيس متبادل) تردد الطول الموجي تغطي طيفا واسعا. التحلل من متعدد الترددالمدخلات والمخرجات الإشارات إلى ناخبيهم باستخدام تحويل فورييه يسمح حساب الجهاز التنفسي مقاومة المدخلات (ZRS)، أي وظيفة النقل بين المدخلات والمخرجات الإشارات، في كل تردد المدرجة في اضطراب 2. ولذلك، FOT يسمح تقييم في وقت واحد لميكانيكا الجهاز التنفسي أكثر من مجموعة من الترددات في 2 مناورة واحدة. النماذج الرياضية المتقدمة المناسب (مثل المرحلة نموذج ثابت 3) لبيانات مقاومة ثم تسمح لتقسيم الاستجابة إلى مجرى الهواء (المركزية والطرفية) ومتني الرئة المعلمات تعتمد الأنسجة 1 و 3. لأن العديد من العوامل التي تؤثر على الاستجابة الفسيولوجية (على سبيل المثال تردد في التنفس، وحجم المد والجزر، وحجم الرئة، بالممرات الهوائية العليا، الجهود التنفس العفوي، توقيت القياسات) يتم التحكم وموحدة من قبل نظام القياس والإجراءات التجريبية، 1 والتقنية هي قبعةقادرة على توليد قياسات دقيقة وقابلة للتكرار شريطة أن يتم تنفيذ ذلك بشكل صحيح. الهدف من هذه المقالة هو لتوفير تفصيلا، وصف التسلسل الزمني للإجراءات اللازمة لتنفيذ هذه القياسات في الفئران. يتكون البروتوكول من أربعة أجزاء هي: الخطوات التحضيرية (الكواشف والمعدات والمواد الدراسية)، والتهوية الميكانيكية، وقياسات وظائف الرئة، وتحليل البيانات. ولدت أمثلة من نتائج ممثل ميكانيكا الجهاز التنفسي باستخدام جهاز التنفس الصناعي مكبس الكمبيوتر التي تسيطر عليها (flexiVent، SCIREQ المؤتمر الوطني العراقي، مونتريال، QC، كندا) وتقدم. تم الحصول على هذه الفئران من السذاجة وكذلك من نموذج يحركها من الإجهاد التأكسدي الضرر الهوائية يتميز التهاب الشعب الهوائية، تلف الخلايا الظهارية وزيادة الاستجابة لمجرى الهواء المستنشق ميثاكولين رذاذ 4. في حين غالبا ما يستخدم هذا البروتوكول لتقييم استجابة مجرى الهواء المستنشق إلى ميثاكولين، بل يمتد إلى نتائج والمتنوع أخرىق الأمراض بما فيها الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، وانتفاخ الرئة، تليف الرئة، إصابة الرئة فضلا عن نماذج الماوس المعدلة وراثيا من الأمراض مماثلة لمرض الإنسان. نتائج البحوث باستخدام هذه الأداة يمكن أن تسهم في توصيف وفهم أفضل للتغيرات الفسيولوجية أو نماذج المرض، وكذلك إلى التوسع في مجالات بحثية جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
الدراسة استمرار ضعف مجرى الهواء من حيث صلته الربو وأمراض الرئة الأخرى لا تزال قصوى لفهم الآليات الكامنة وراء المرض وتطوير خيارات العلاج. وقد تم استخدام الفئران لنموذج المرض الهوائية أساسي في الحصول على فهم آليات المرض في هذه. عند النظر في تقييم ضعف مجرى الهواء في موضوع صغيرة مثل الماوس، وجود أدوات موثوقة ودقيقة يمكن من خلالها قياس وظائف الرئة أمر بالغ الأهمية. وعلاوة على ذلك، وجود أدوات قادرة على تقديم رؤى على موقع مجرى الهواء أو ضعف التأثير العلاجي لا تقدر بثمن. يجمع بين تقنية FOT كل هذه الصفات ويوفر نهجا قوية، تكاملية ومتعدية لتقييم التغيرات الفسيولوجية.
لكي تنجح مع هذا النوع من القياس في الفئران، وينبغي إيلاء اهتمام خاص لبضع خطوات، وهي معايرة النظام، ومقاومة CA القصبة الهوائيةnnula، نوع من البخاخات (وكذلك إعدادات التشغيل) لتحديد المواقع من الحيوان وتوحيد الرئة التاريخ حجم. وبالإضافة إلى ذلك، لا بد من أجل الحصول على مجموعات البيانات صالحة أن الجهاز التنفسي هذا الموضوع لا يزال السلبي خلال القياسات. ويمكن تحقيق ذلك من خلال إدارة وكيل تشل العضلات، ويعمل في الطائرة عميقة من التخدير أو عن طريق اللهاث هذا الموضوع للحث على توقف التنفس أثناء (انظر الجدول 1). يمكن للمحققين تبدأ من خلال اتقان النظام والبرامج التشغيلية، إذا رغبت في ذلك، مع الأحمال اختبار، في حين اكتساب المهارات اللازمة للقياسات في الفئران. وسيكون من المنطقي ثم لتوليد نتائج قابلة للتكرار في الحيوانات ساذجة قبل أن ينتقل إلى نماذج المرض أو الفئران المعالجة. إذ أن نسبة هامة من نماذج مرض في الجهاز التنفسي تشمل البحوث تعريض الحيوانات لعوامل مثل المواد المثيرة للحساسية، والسموم والملوثات، ودخان السجائر أو الغازات، وتقلب في النتائج المتحصل عليها مع measuremenيمكن بالتالي ر تقنية الموضحة في هذه المقالة أن يتأثر الإجراء التعرض المستخدمة. توحيد العمليات التجريبية الرئيسية (مثل التعرض باستخدام الكمبيوتر التي تسيطر عليها ونظم قياس 6، 13، 14) يمكن أن يكون لها تأثيرا كبيرا في الحد من التباين.
الأمثلة المقدمة في هذه المقالة تمثل مجموعة مختارة من نتائج نموذجية من السذاجة والكلور المعرضة للفئران التجارب مع تسليط الضوء على نقاط القوة وكذلك القيود المفروضة على تقنية. كما يمكن أن يرى على سبيل المثال في الشكل (6)، والتقنية هي قادرة على توليد استنساخه قياسات وظائف الرئة. في حين تم الإبلاغ عن قيم المقاومة خط الأساس مماثلة بين سلالات الفئران، ولكن لوحظ اختلاف في مرانية 15. تغييرات كبيرة هي أيضا من المتوقع بين الرضع والفئران البالغة 16. أما بالنسبة للأخرى في الجسم الحي تقييم الفسيولوجية، ونتائج عالية الدقة، مثل البيئة نظام التشغيل التي تم إنشاؤها بواسطة FOT، وتأتي مع تنازل عن الحالة الطبيعية من الموضوعات. هذا المبدأ، الذي يشار إليه على أنه مبدأ عدم اليقين phenotyping 1، ينطبق على هذا البروتوكول، بمعنى أن القياسات تحتاج إلى أن يتم في تخدير، tracheotomised (أو مدخل أنبوب شفويا) والتهوية ميكانيكيا المواضيع. يتم ملاحظتها الحد آخر من تقنية في الشكل 5D-5F حيث لم تكن البيانات متاحة على أعلى تركيزات للمجموعة الكلور المعرضة لأن نوبة من المرحلة ثابت نموذج للبيانات ضعيفة فوق مستويات معتدلة من ضيق الشعب الهوائية. ومع ذلك، يمكن تقييم الحيوانات bronchoconstricted بشدة من خلال تحليل ZRS مباشرة 15، أو باستخدام طرف ثالث البرمجيات في مرحلة ما بعد التحليل لتناسب النماذج الرياضية أكثر تعقيدا، على سبيل المثال مع مراعاة عدم تجانس وظيفة الميكانيكية 17. ويمكن أيضا ملاحظة مجموعات البيانات استبعادها اذا الخطوط الجوية الحيوان ليست كافية فassive أو إذا كانت المقاومة للقنية عالية جدا. وكقاعدة عامة من الإبهام، وينبغي مقاومة قنية لا تتجاوز مقاومة الحيوان في الأساس. وسوف تعمل مع قنية من القطر الداخلي أكبر و / أو أقصر طول يساعد على التقليل من مقاومة قنية. وأخيرا، قد ينظر إلى المظاهرة الحالية للقياسات FOT في الفئران كمنهجية تستغرق وقتا طويلا، وبالتالي أقل كفاءة أو أقل ينطبق على دراسات طولية مقارنة مع تقنيات أقل الغازية. ومع ذلك ترتبط هذه الأخيرة مع قدر كبير من عدم اليقين فيما يتعلق أساس نتائجها وينظر إليها من قبل العديد على أنها معيبة 1. القياسات الغازية المتكررة ممكنة في الحيوانات مدخل أنبوب شفويا، على الرغم من أن أكثر تحديا من الناحية التقنية 17.
من الأمثلة المقدمة، أظهرت النتائج تكافؤ الجيلين من النظام flexiVent في إنتاج قياسات الميكانيكا الجهاز التنفسي، وكذلك مجرى الهواء hyperreactivity وفرط الحساسية للميثاكولين استنشاق الكلور بعد التعرض في الفئران. عندما تستخدم لوصف أو فهم التغيرات الفسيولوجية أو نماذج المرض، فإن الجانب قياس التفصيلية المتصلة تقنية يمكن أن تساهم في تمديد الوضع الحالي للمعرفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم TKMcG من قبل دراسية لمن جمعية أمراض الصدر الكندية.
مساهمة المؤلفين
اخذ كل جزء من الكتاب في مفهوم المخطوطة. وبالإضافة إلى ذلك، شرع TKMcG المشروع، جمعت النتائج التجريبية، ساهم في كتابة المخطوطة واستعراضها حرجة. AR جمعها وتحليل النتائج التجريبية، صياغة المخطوط وساهم في استعراضه حرجة. LF جمعت النتائج التجريبية وساهم في مراجعة نقدية للمخطوطة. TFS وJGM ساهم في مراجعة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
| Micro-Adson forceps, serrated 12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Moria MC31 forceps, serrated-curved | Fine Science Tools | 11370-31 | |
| Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Spring scissors-2.5 mm blades, straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Non-sterile blunt needle (18g x ½”) | Brico Medical Supplies Inc. | BN1805 | Endotracheal cannula |
| Non-sterile 5-0 silk suture | Seraflex | IDI58000 | |
| Phosphate buffered solution | Gibco | 14190-144 | |
| 15 ml conical tubes | Starstedt | SS-4001 | |
| 1 ml TB syringes | Becton Dickinson | 309626 | |
| 200 μl filter tips | Biosphere | 70.760.211 | |
| EQUIPMENT | |||
| flexiVent FX | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
| Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
References
- Bates, J. H. T., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J. Appl. Physiol. 94, 1297-1306 (2003).
- Bates, J. H. T. . Lung mechanics. An inverse modeling approach. , (2009).
- Hantos, Z., Daroczy, B., Suki, B., Nagy, S., Fredberg, J. J. Input impedance and peripheral inhomogeneity in dog lungs. J. Appl. Physiol. 72, 168-178 (1992).
- McGovern, T. K., et al. Dimethylthiourea protects against chlorine induced changes in airway function in a murine model of irritant induced asthma. Respir. Res. 11, 138 (2010).
- Hayes, R. D., Beach, J. R., Rutherford, D. M., Sim, M. R. Stability of methacholine chloride solutions under different storage conditions over a 9 month period. Eur. Respir. J. 11, 946-948 (1998).
- North, M. L., et al. Augmentation of arginase 1 expression by exposure to air pollution exacerbates the airways hyperresponsiveness in murine models of asthma. Respir. Res. 12, (2011).
- Siddiqui, S., et al. Site of allergic airway narrowing and the influence of exogenous surfactant in the brown norway rat. PloS ONE. 7, e29381 (2012).
- Cohen, J. C., Lundblad, L. K. A., Bates, J. H. T., Levitzky, M., Larson, J. E. The “Goldilocks Effect” in cystic fibrosis: identification of a lung phenotype in the cftr knockout and heterozygous mouse. BMC Genetics. 5, 21 (2004).
- Shalaby, K. H., Gold, L. G., Schuessler, T. F., Martin, J. G., Robichaud, A. Combined forced oscillation and forced expiration measurements in mice for the assessment of airway hyperresponsiveness. Respir Res. 11, 82 (2010).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. J. Appl. Physiol. 109, 1960-1968 (2010).
- Amatullah, H., et al. Comparative cardiopulmonary effects of size-fractionated airborne particulate matter. Inhalation Toxicology. 24, 161-171 (2012).
- Salazar, E., Knowles, J. H. An analysis of pressure-volume characteristics of the lungs. J. Appl. Physiol. 19, 97-104 (1963).
- Balakrishna, S., et al. Environmentally persistent free radicals induce airway hyperresponsiveness in neonatal rat lungs. Particle Fibre Tox. 8, 11 (2011).
- Fahmy, B., et al. In vitro and in vivo assessment of pulmonary risk associated with exposure to combustion generated fine particles. Environ. Toxicol. Pharmacol. 29, 173 (2010).
- Duguet, A., et al. Bronchial responsiveness among inbred mouse strains. Role of airway smooth-muscle shortening velocity. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161, 839-848 (2000).
- Bozanich, E. M., et al. Developmental changes in airway and tissue mechanics in mice. J. Appl. Physiol. 99, 108-113 (2005).
- Schwartz, B. L., et al. Effects of central airway shunting on the mechanical impedance of the mouse lung. Ann. Biomed. Eng. 39, 497-507 (2011).
- De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
- Takubo, Y., et al. α1-Antitrypsin determines the pattern of emphysema and function in tobacco smoke-exposed mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 166, 1596-1603 (2002).
- Salerno, F. G., et al. Effect of PEEP on induced constriction is enhanced in decorin-deficient mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1111-L1117 (2007).
- Therien, A. G., et al. Adenovirus IL-13-induced airway disease in mice. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 39, 26-35 (2008).
- Bates, J. H. T., Cojocaru, A., Lundblad, L. K. A. Bronchodilatory effect of deep inspiration on the dynamics of bronchoconstriction in mice. J. Appl. Physiol. 103, 1696-1705 (2007).
- Wagers, S. S., et al. Intrinsic and antigen-induced airway hyperresponsiveness are the result of diverse physiological mechanisms. J. Appl. Physiol. 102, 221-230 (2007).
- Collins, R. A., Sly, P. D., Turner, D. J., Herbert, C., Kumar, R. K. Site of inflammation influences site of hyperresponsiveness in experimental asthma. Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 51-61 (2003).
- Bishai, J. M., Mitzner, W. Effect of severe calorie restriction on the lung in two strains of mice. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L356-L362 (2008).
- Song, W., et al. Postexposure administration of β2-agonist decreases chlorine-induced airway hyperreactivity in mice. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 45, 88-94 (2011).
- Hirota, J. A., Ellis, R., Inman, M. D. Regional differences in the pattern of airway remodeling following chronic allergen exposure in mice. Respir. Res. 7, 120 (2006).
- Llop-Guevara, A., et al. In vivo-to-in silico iterations to investigate aeroallergen-host interactions. PloS ONE. 3, e2426 (2008).
