Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Tahlil çeşitli biçimlerde çalışır, ancak biz özellikle reaktifler, CCF4-AM kaydetmek için örnek hacmi aşağı ölçeklendirme tavsiye ederiz. Bu nedenle, aşağıdaki protokol 35 mm ebadındaki bir cam alt yemekler canlı HeLa hücreleri, daha sonra da, 96 gözlü bir formatta, sabit ya da HeLa hücreleri THP-1 makrofaj-benzeri hücreler için açıklanmıştır. Tahlil, diğer patojenlerin için adapte edilebilir. Shigella enfeksiyonları yanı sıra, THP-1 phagocytosing farklı m-Y cobacterial suşları için analiz tarif eder. Önemlisi, CCF4-AM yükleme sonra, yıkama tamponları dahil olmak üzere tüm reaktifler ve tamponlar 1 mM Probenesid varlığını gerektirir. Probenesid protokolünün tüm adımları boyunca CCF4 sitozolik tutma teşvik eden bir anyon kanalı inhibitörüdür. CCF4 sinyal uzun süreler için kararlı olmadığı için sabit örnekleri deney sonra birkaç saat içinde elde edilmelidir. 1. Shigella f kullanarak Sabit Örnekleri üzerinde CCF4 Testilexneri (96 Peki Tabaklar) Gece kültürler için bakteri hazırlanması. Bakteriyel ön-kültürler vahşi tip (M90T AfaI) ve mutant (BS176 AfaI) suşu 37 ° C'de gece boyunca bir çalkalayıcı ampisilin (50 ug / ml) ile desteklenmiş 8 ml triptik soya suyu kazein (TCSB) enfeksiyon 1 gün önce inoküle . Bulaşmasına Kaplama hücreleri. DMEM bir son hacim içinde,% 5 CO2 inkübatör içinde% 10 Fetal Buzağı Serumu (FCS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren içinde oyuk başına 5 x 10 3 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu plakalar, enfeksiyondan önce 1. gün Tohum HeLa hücrelerinde 100 ul. THP-1 makrofaj benzeri hücre durumunda, hücre kaplama 5 x 10 4 hücre / iyi bir yoğunlukta 2 gün enfeksiyondan önce yapılır, ve% 10 ihtiva eden RPMI içinde 30 nM'lik Forbol Miristat Asetat (PMA) ile inkübe edilir Fetal Buzağı Serumu (FCS),% 1 penisilin-streptomisin ve 0.05 mM 2-merkaptoetanol. Alt kültür için bakteri hazırlanması. Gece bakteri kültürleri inoküle2.5 saat (OD600 = 0,3 ila 0,4) için 37 ° C de 50 mg / bir çalkalayıcı ml ampisilin ile desteklenmiş TCSB bir 1/100 dilüsyon. CCF4-AM ile hücreleri yükleniyor. De 1 mM probenesit (Sigma), 1.5 uM CCF4-AM (THP-1 durumunda, 6 mm) ve yükleme B çözeltisi, 1.25 ml (100 mg başına 25 ul'lik bir son hacim CCF4-AM yükleme karışımı hazırlamak EM / ml Invitrogen CCF4-AM LiveBlazer yükleme takımı boyunca temin DMSO/0.1% asetik asit içinde, Pluronic F 127-yüzey aktif madde) tampon maddesi (120 mM NaCl, 7 mM KCI, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 5 mM glikoz, pH 7.3) içinde de 25 mM HEPES. Bir kez PBS ile yıkayın ve hücreler, 2.5 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında oyuk başına CCF4-AM yükleme karışımı 25 ul ekleyin. Bakteri enfeksiyonu için hazırlanması. 1 dakika 9.000 rpm'de bakteriyel alt kültür 1 ml Spin. 10 ug / ml poli-L-lisin (Sigma) ve 40 ug / ml β-lacta ile takviye edilmiş 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve 1 dakika için 9000 rpm'de 500 ul PBS ile bir kez yıkayın sıkma(Sigma) mase. , Oda sıcaklığında, bir dönen bir tekerlek üzerinde inkübasyondan 10 dakika sonra, 500 ul EM tampon / 1 mM probenesit 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve bakteri ile bir kez yıkayın. Hücre enfeksiyon ve fiksasyon. 150 ul PBS / 1 mM probenesit ile bir kez yıkama hücreleri, EM tampon 100 ul / 1 mM probenesit bir son hacim içinde tekrar süspanse bakteri 10 ul bir karışımını hazırlamak ve her bir kuyuya dağıtın. , Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübasyondan sonra, 1 saat (THP-1 durumunda, 90 dakika) için 37 ° C ile plaka geçiş, 150 ul PBS / 1 mM probenesid ile yıkama ve 50 ul% 4 paraformaldehit ile düzeltmek / 1 mM, karanlıkta 10 dakika boyunca probenesid. Daha sonra, 10 uM çekirdekleri boya Draq5 (Biostatus) 30 ul ile 30 dakika inkübe edilir ve 150 ul PBS / 1 mM probenesit, ile yıkayın, 150 ul PBS / 1 mM probenesid ile yıkama ve 100 ul PBS / 1 mM probenesit örnekleri bırakın. Sabit örnekler alındıktan ayarları. Toplama ya (i), bir ters Epifloresans mikro kullanılarak gerçekleştirilir20x (0.5 Sayısal Diyafram (NA), 2.1 Çalışma Mesafesi (WD)) veya 40x (0.75 NA, 0.72 WD) N-Planı hava objektif ya da (ii) 10x objektif ile bir konfokal mikroskop kullanılarak baş. Floresan görüntüleme 405 nm uyarma ile yapılan (Semrock, FF01-387/11-25) ve emisyon 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) ve 535 nm filtreler (Semrock, yoluyla tespit edilir FF01-520/35- 5 msn (iletilen ışık), 1000 msn (535 nm) ve 500 msn (450 nm) pozlama süreleri kullanarak 25). 240 msn (450 nm) ve 640 nm lazer için 405 nm lazer (870 μW), 640 msn (Draq5) (2.560 μW) için 360 msn (535 nm): konfokal görüntüleme aşağıdaki pozlama süresi kullanılarak yapılır. Alım sonrası analizi. Bunun ardından, resim her bir hücre için floresans sinyalinin otomasyonlu bir puanlama sağlayan bir bilgisayar algoritması tarafından analiz edilmiştir. Bu Metamorph 7.1 veya Acapella olarak Yazılım (isteğe bağlı) 450nm ve 535nm emisyon sinyalleri arasındaki oranı ölçmek için bir komut dosyası oluşturmak için kullanılabilir. Not, satın alma sırasında otomatik mikroskopi bağlanmış bir odak kalibrasyon cihazının kullanımı aynı anda birden kuyularda farklı pozisyonlarda onlarca elde sağlar. 2. Shigella flexneri (35 mm Cam-alt Biçimi, Mattek) kullanarak Canlı Örnekleri üzerinde CCF4 Testi Gece kültürler için bakteri hazırlanması. Daha önce tarif edildiği gibi devam edin. Bulaşmasına Kaplama hücreleri. 2 x 10 5 hücre / 2 ml 'lik bir son hacim içinde, çanak bir yoğunlukta 35 mm ebadındaki bir cam alt kültür kaplarına (Mattek 10 mm Microwell, Mattek Corporation), enfeksiyondan önce 1. gün Tohum HeLa hücreleri. Alt kültür için bakteri hazırlanması. Daha önce tarif edildiği gibi devam edin. CCF4-AM ile hücreleri yükleniyor. Daha önce tabak başına 2 ml 'lik bir son hacim için tarif edildiği gibi CCF-AM yükleme karışım hazırlayın. Yüklemeden önce, bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. Bakteri enfeksiyonu için hazırlanması. Daha önce tarif edildiği gibi devam edin. AcquisitCanlı örneklerinin iyon ayarlar. Toplama bir 37 ° C ısıtma odasının içine bir 20x (0.5 NA, 2.1 WD) veya 40x (0.75 NA, 0.72 WD) N-Planı hava objektif kullanarak ters Epifloresans mikroskop ile 60 dakika her 90 saniye için yapılır. Floresan görüntüleme 405 nm uyarma ile yapılan (Semrock, FF01-387/11-25) ve emisyon 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) ve 535 nm filtreler (Semrock, yoluyla tespit edilir FF01-520/35- 5 msn (iletilen ışık), 200 msn (535 nm) ve 100 msn (450 nm) pozlama süreleri kullanarak 25). Hücre enfeksiyon ve canlı satın alma. 2 ml PBS / 1 mM probenesid ile bir kez hücreleri yıkayın,, EM 2 ml / 1 mM probenesid ekleyin mikroskop sahnede çanak monte ve satın alma başlar. 6 dakika (zaman noktasında 4), beklemeye satın alma koymak sonra, hücreler üstünde bakteri tabanda 250 ul ekleyin ve satın alma yeniden başlatın. Alım sonrası analizi. Filmler Metamorph veya ImageJ kullanarak görüntülenebilir. Her vermemek için 450/535 nm şiddet oranlarıçift ​​hücre ImageJ kullanılarak elde edilebilir. Daha önce de belirtildiği gibi, satın alma sırasında otomatik mikroskopi bağlanmış bir odak kalibrasyon cihazının kullanımı zaman atlamalı bağlı olarak birden fazla farklı pozisyonlarda edinme sağlar. 3. Kullanımı Sabit Örnekleri üzerinde CCF4 Testi Mikobakteriler (96 Peki Biçimi) Bakteri hazırlanması. Büyümek 30 ° C (Mycobacterium marinum için) veya 37 ° C (Mycobacterium bovis BCG ve Mycobacterium tuberculosis için) katalaz albümin dekstroz (ADC) içeren 7H9 içinde orta-log fazı için mikobakteri suşları. Bulaşmasına Kaplama hücreleri. 2 gün enfeksiyon önceki Levha THP-1 makrofajlar RPMI içinde 30 nM PMA% 10 içeren kuluçka Fetal Buzağı Serumu (FCS), bir nihai hacim içinde,% 5 CO2 inkübatör içinde% 1 penisilin-streptomisin ve 0.05 mM 2-merkaptoetanol 5 x 10 4 hücre / iyi bir yoğunlukta 100 ul. Bakteri enfeksiyonu için hazırlanması. Harvest kültürleri, yıkama ve topaklanma önlemek amacıyla, bir şırınga aracılığıyla sonikasyon ve filtrasyon öncesi PBS ile tekrar süspansiyon haline getirin. OD600 ölçümü ile, her bir suş konsantrasyonunu belirlemek ve% 5 ile 30 ° C (Mycobacterium marinum için) veya RPMI ortamı içinde 37 ° C (Mycobacterium bovis BCG ve Mycobacterium tuberculosis için) bir MOI 1:1 az THP-1 hücreleri enfekte CO 2. 2 saat sonra, orta kaldırmak PBS ile 3 defa yıkanır ve 1-2 gün (Mycobacterium marinum olması durumunda) ya da 3-7 gün (Mycobacterium bovis BCG ve Mycobacterium tuberculosis durumunda) için tam taze ortam ilave edin. CCF4-AM ve tespit ile hücreleri yükleniyor. Bir kez PBS ile yıkayın ve hücreler daha önce 6 uM'lik bir CCF4-AM nihai konsantrasyon kullanarak oyuk başına 25 ul son hacim olması için tarif edildiği gibi CCF4-AM yükleme karışımı hazırlamak. Yükleme 150 ul PBS / 1 mM probenesit ile yıkanmadan önce 2 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında gerçekleşir ve düzeltmek% 4 paraformaldehid ile 50 ul ation karanlıkta 30 dakika boyunca with1 mM probenesid desteklenmiştir. Daha sonra, 150 ul PBS / 1 mM probenesid ile yıkayın ve 100 ul PBS / 1 mM probenesid örnekleri bırakın. Toplama ayarları ve alım sonrası analizi. Daha önce Shigella flexneri kullanarak ilk paragrafta açıklandığı gibi devam edin. Ek protokolü Fluorimetrik bakterilerin yüzeyinde β-laktamaz kontrol etmek için gerçekleştirilir. Bu tarif edilen analizde kullanılmak üzere tasarlanmış her bir bakteri suşu için yapılmalıdır. Bu amaç için, yıkanmış bakterilerin karanlık içinde 37 ° C 'de 1 saat süreyle 1 ml PBS içinde 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml domuz karaciğer esteraz özü (Sigma) ile temas halinde yerleştirilir. Çözünür laktamaz 1 mg / ml (Invitrogen), bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Daha sonra, bir emisyon taraması, bir PTI Quantamaster florimetresi ve 1 ml'lik bir litre kullanılarak 405nm uyarma gerçekleştirilirz küvet. Kaybı 535 nm'de FRET ve yüksek bir 450 nm tepe görünümünü CCF4 prob için bakteri ilave edildikten sonra görüntülenmiştir.