細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

アッセイは、様々な形式で動作しますが、しかし、我々は、特に試薬、CCF4-AMを保存するためにサンプル量をスケールダウンをお勧めします。したがって、以下のプロトコルが35ミリガラスボトムディッシュにHeLa細胞ライブし、次いで、96ウェルフォーマットで固定したHeLa細胞又はTHP-1マクロファージ様細胞に記載されている。アッセイは、他の病原体に適合させることができる。 赤痢菌感染に加えて、我々はTHP-1は、異なるM Y cobacterial株を ​​貪食するためのアッセイを記述します。 重要なのは、CCF4-AMロード後、洗浄バッファーを含むすべての試薬およびバッファーは1 mMのでプロベネシドの存在を必要とする。プロベネシドは、プロトコルのすべてのステップを通してCCF4の細胞質の保持を促進するアニオンチャネル阻害剤である。 CCF4信号は長時間にわたって安定していないので、固定のサンプルは、実験後数時間以内に取得する必要があります。 1。 赤痢菌Fを使用した固定サンプルでCCF4アッセイlexneri（96ウェルプレート） 一晩培養するための細菌を準備。細菌プレ文化野生型（赤痢菌AfaI）および変異（BS176 AfaI）株37℃で一晩振とう機にアンピシリン（50μgの/ ml）で補足8ミリリットルトリプシンカゼイン大豆ブロス（TCSB）での感染の1日前に接種。 感染のめっきセル。最終容積の5％CO 2インキュベーター内で10％ウシ胎児血清（FCS）および1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM中でウェルあたり5×10 3細胞の密度で96ウェルプレート感染前1日にシードHeLa細胞100μlに。 THP-1マクロファージ様細胞の場合には、細胞播種は、5×10 4細胞/ウェルの密度で2日間感染の前に行われ、それらは10％を含有するRPMI中で30 nMのホルボールミリスチン酸アセテート（PMA）と共にインキュベートするウシ胎児血清（FCS）、1％ペニシリン – ストレプトマイシンおよび0.05 mMの2 – メルカプトエタノール。 サブカルチャーのために細菌を準備。一晩細菌培養に接種2.5時間（OD600 = 0.3〜）のために37℃で50μgの/シェーカーでアンピシリンを補っTCSBで1/100希釈で。 CCF4-AMで細胞を読み込んでいます。 CCF4-AMをウェルあたり25μlの最終容量のための組合せを読み込ん1mMのプロベネシド（Sigma社製）、1.5μMCCF4-AM（THP-1の場合6μM）とB液（100mgのをロード1.25μLを含むを準備/ mlのプルロニック-F127 Invitrogen社CCF4-AM LiveBlazerローディングキットに沿って設けられDMSO/0.1％酢酸中の界面活性剤）EMバッファー（120mMのNaClを、7のKCl、1.8mMのCaCl 2を、0.8のMgCl 2、5mMグルコース、内pHは7.3）に25 mMのHEPES。 PBSで細胞を1回洗浄し、2.5時間、暗所で室温でウェル当たりCCF4-AMローディングミックス25μLを加える。 感染細菌を準備。 1分間9,000 rpmで細菌のサブカルチャーを1mlスピン。 10μgの/ mlのポリ-L-リジン（Sigma社）および40μgの/ mlのβ-lactaを補充した500μlのPBSで1分間再懸濁しために9,000 rpmでスピン、500μlのPBSで1回洗浄する（シグマ）間瀬。室温で回転ホイールでのインキュベーションの10分後、500μlのバッファーEM /の1mMプロベネシドで500μlのPBSで再懸濁しバクテリアで一度洗う。 細胞感染および固定。プロベネシド150μlのPBS / 1 mmの細胞を1回洗浄し、EMバッファー/ 1ミリメートルプロベネシド100μlの最終容量中に再懸濁し、細菌を10μlのミックスを調製し、各ウェルに、それを配布します。室温で暗所で15分間インキュベートした後、1時間（THP-1の場合は90分）を37℃にプレートを切り替える、150μlのPBS / 1ミリメートルプロベネシドで洗浄し、50μlのホルムアルデヒド4％で固定/ 1mMのは暗闇の中で10分間プロベネシド。その後、10μM核染料DRAQ5（Biostatus）30μlのと30分間インキュベート150μlのPBS / 1ミリメートルプロベネシド、で洗浄、150μlのPBS / 1ミリメートルプロベネシドで洗浄し、100μlのPBS / 1ミリメートルプロベネシドのサンプルを残して。 固定されたサンプルの取得設定。買収は、（i）は倒立エピ蛍光ミクロスを使用していずれかで実行される10倍を目的とした共焦点顕微鏡を用いて20倍（0.5開口数（NA）、2.1作動距離（WD）​​）または40倍（0.75 NA、0.72 WD）N-プラン空気目的または（ii）にも対応しています。蛍光イメージングは​​、405 nmで励起し実行（Semrock、FF01-387/11-25）と排出量は450 nmの（Semrock、FF02-447/60-25）および535 nmのフィルター（Semrock、を介して検出されFF01-520/35- 5ミリ秒（透過光）の露光時間、1,000ミリ秒（535 nm）を、500ミリ秒（450 nm）を用いた25）。共焦点イメージングは​​、以下の露光時間を使用して実行されます：405 nmレーザー（870μW）のために240ミリ秒（450ナノメートル）と360ミリ（535 nm）を、640 nmレーザー（2560μW）のために640ミリ秒（DRAQ5）。 取得後の分析。続いて、画像は、個々の細胞について、蛍光シグナルの自動採点を可能にするコンピュータアルゴリズムによって分析される。このような変形者7.1やアカペラなどのソフトウェアは、（リクエストに応じて利用可能）と450nmの535nmの発光信号間の比を測定するためのスクリプトを作成するために使用することができ。注目すべきは、取得時に自動顕微鏡に結合された焦点較正装置の使用は、同時に複数のウェル内の異なる位置の数十を取得することができる。 2。 赤痢菌を使用したライブサンプルでCCF4アッセイ（34 mmガラスボトムフォーマット、マテック） 一晩培養するための細菌を準備。前述のように進みます。 感染のめっきセル。 2ミリリットルの最終体積で2×10 5細胞/ディッシュの密度で35ミリのガラス底培養皿（マテック10ミリメートルマイクロウェル、マテック株式会社）感染症の1日前に種子HeLa細胞。 サブカルチャーのために細菌を準備。前述のように進みます。 CCF4-AMで細胞を読み込んでいます。以前に皿あたり2 mlの最終容積について記載したようにCCF-AMローディングミックスを調製する。ロードする前に、PBSで1回細胞を洗浄。 感染細菌を準備。前述のように進みます。 Acquisitライブサンプルのイオン設定。買収は37℃加熱室内20X（0.5 NA、2.1 WD）または40倍（0.75 NA、0.72 WD）N-プラン空気対物レンズを用いて倒立落射蛍光顕微鏡で60分ごとに90秒間実行されます。蛍光イメージングは​​、405 nmで励起し実行（Semrock、FF01-387/11-25）と排出量は450 nmの（Semrock、FF02-447/60-25）および535 nmのフィルター（Semrock、を介して検出されFF01-520/35- 5ミリ秒（透過光）、200ミリ秒（535 nm）とし、100ミリ秒（450ナノメートル）の露光時間を用いて25）。 細胞感染およびライブ買収。 EM /の1mMプロベネシド2 mlを加え、2つのmlのPBS / 1ミリメートルプロベネシドで一回細胞を洗浄し、顕微鏡のステージ上にお皿をマウントして取得を開始します。 6分（時点4）の後、保留に買収を入れた細胞の上に細菌懸濁液250μlを追加し、買収を再起動します。 取得後の分析。映画は変形者またはImageJのを使って可視化することができる。各INDIVIための535分の450 nmの強度比デュアルセルは、ImageJのを用いて得ることができる。前述したように、取得時に自動顕微鏡に結合された焦点較正装置の使用は、時間経過に応じて複数の異なる位置を取得することができる。 3。使用して、固定サンプルにCCF4アッセイ マイコ（96ウェルフォーマット） 細菌を準備する。育つ 30°C（ 結核marinumの場合）または37℃（ ウシ型結核菌 BCGと結核菌用）でカタラーゼアルブミンデキストロース（ADC）を含む7H9における中期対数期にマイコバクテリア菌株。 感染のめっきセル。 10％ウシ胎児血清（FCS）、1％ペニシリン-ストレプトマイシンおよび最終容積の5％CO 2インキュベーター中0.05mMの2 -メルカプトエタノールを含有するRPMI中で30 nMのPMAでそれらをインキュベート1-2日感染前板THP-1マクロファージ5×10 4細胞/ウェルの密度で100μlの。 感染細菌を準備。 HARVESTの文化は、洗って凝集を避けるために、注射器を通して超音波処理し、ろ過前にPBSで再懸濁します。 OD600測定により各菌株の濃度を決定し、5％、30°C（ 結核marinumの場合）またはRPMI培地中で37°C（ ウシ型結核菌 BCGと結核菌用）でMOI 1:1でTHP-1細胞に感染CO 2。 2時間後、培地を除去し、PBSで3回洗浄し、1-2日（ 結核marinumの場合）、または3〜7日（ ウシ型結核菌 BCGと結核菌の場合）のための完全な新鮮な培地を追加します。 CCF4-AMと固定で細胞を読み込んでいます。 PBSで1回細胞を洗浄し、以前6μMのCCF4-AM最終濃度を使用してウェル当たり25μlの最終容量について説明したようCCF4-AMローディングミックスを調製する。ロードは150μlのPBS / 1ミリメートルプロベネシドで洗浄前に2時間、暗所で室温で行われ、修正4％で50μlのホルムアルデヒドを使用してATIONは暗闇の中で30分間プロベネシドwith1 mMのを補足。その後、150μlのPBS / 1ミリメートルプロベネシドで洗浄し、100μlのPBS / 1ミリメートルプロベネシドのサンプルを残して。 取得設定と取得後の分析。以前に赤痢菌を使用して最初の段落で説明したように進んでください。 補足プロトコル蛍光アッセイは、細菌の表面でβ-ラクタマーゼの活性を確認するために行われる。これは、記載されたアッセイで使用するためのもので、各菌株に対して行われるべきである。この目的のために、洗浄した細菌は、暗闇の中で37℃で1時間、PBS 1mlに100 nMのCCF4-AM（Invitrogen社）、50μgの/ mlのブタエステラーゼ肝臓エキス（シグマ）に接触させている。可溶性ラクタマーゼ1 mg / mlの（Invitrogen社）をポジティブコントロールとして使用することができる。そして、発光スキャンPTI Quantamasterの蛍光と、1mlのクォートを使用して405nmの励起で行われるzのキュベット。の損失は535 nmでFRETと高い450 nmのピークの出現はCCF4プローブに細菌の添加時に可視化する。