מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים
Summary
אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך תאיים<em> Shigella flexneri<em></em</em> ו<em<em><em> Mycobacterium tuberculosis</em></em</em> על פלישת תא מארחת. assay שלנו עושה שימוש בCCF4, מארח cytoplasmic סריג בדיקה בתאים חיים או קבועים. הכתב הזה הוא מושפל על ידי הווה פעילות אנזים על פני החיידקים.
Abstract
Shigella flexneri הם חיידקים פתוגניים כי לפלוש לתוך תאי מארח נכנסים vacuole endocytic. לאחר מכן, הקרע של קרום תא מוקף זה מאפשר לחיידקים לנוע בתוך cytosol, להתרבות ועוד לפלוש לתאים שכנים. Mycobacterium tuberculosis הוא phagocytosed על ידי תאי מערכת חיסון, ולאחרונה הוכח קרום phagosomal קרע במקרופאגים. פיתחנו assay חזק למעקב אחר שיבוש קרום phagosomal לאחר כניסת תא המארחת של Shigella flexneri או Mycobacterium tuberculosis. הגישה עושה שימוש CCF4, סריג כתב רגיש לβ-lactamase שequilibrates בcytosol של תאי מארח. עם הפלישה של תאי מארח על ידי חיידקים פתוגנים, החללית נשארת שלמה כל עוד החיידקים מתגוררים בתאי קרום סגורים. לאחר שיבוש פעילות vacuole, β-lactamase על פני השטח של הפתוגן דבק תאיים CCF4 באופן מיידי להובילing להפסד של סריג אות ומיתוג ספקטרום הפליטה שלה. assay ratiometric חזק זה מניב מידע מדויק על העיתוי של קרע vacuolar הנגרם על ידי החיידקים הפולשים, וזה יכול להיות בשילוב למיקרוסקופיה האוטומטית ועיבוד תמונה על ידי אלגוריתמים מיוחדים לזיהוי של את אותות הפליטה של סריג תורם acceptor. יתר על כן, היא מאפשרת לחקור את הדינמיקה של שיבוש vacuolar שהושרו על ידי חיידקים תאיים בזמן אמת בתאים בודדים. לבסוף, הוא מתאים באופן מושלם לניתוח תפוקה גבוהה עם רזולוציה מרחב ובזמן העולה על שיטות קודמות. כאן, אנו מספקים את הפרטים הניסיוניים של פרוטוקולים למופת עבור assay קרע vacuolar CCF4 על תאי הלה ומקרופגים THP-1 לניסויי זמן לשגות או ניסויי נקודות קצה באמצעות Shigella flexneri כמו גם זנים רבים mycobacterial כגון Mycobacterium marinum, Mycobacterium בוביס, ושחפת Mycobacterium.
Introduction
חיידקים פתוגנים רב הם הפנימו בתאי קרום של תאים סגורים אוקריוטים במהלך קורס זיהום שלהם. כניסה לתא מתרחש גם דרך phagocytosis ידי תאי מארח מיוחדים, כמו במקרה של שחפת Mycobacterium שהם מעובדים על ידי מקרופאגים, או גורמי המחלה באופן פעיל לגרום לספיגה שלהם לתוך בדרך כלל תאים שאינם phagocytic. במקרה של ספיגה הנגרמת, למשל לShigella flexneri, הפתוגן מזריק חלבונים למפעיל המארח שcytosol לחטוף בין פונקציות תאים אחרות מכונות מיון endomembrane מוסדרות היטב וכתוצאה מכך לוקליזציה חיידקים בתוך תא 1,2 endosomal. כתוצאה מכך, Shigella משבש את הקרום מצרף מוביל לקרע vacuolar והגישה cytosolic של הפתוגן מפריע לסחר קרום מארח ומשלוח הימנעות ליזוזום. לאחרונה, קרע phagolysosomal נמצא גם כstr זיהוםategy בשימוש על ידי Mycobacterium tuberculosis, הפתוגן שחשב במשך זמן רב שיש באופן בלעדי מקומי בתוך תא קרום הנכנס 3,17.
כדי לחקור את הדינמיקה של סחר קרום subcellular של פתוגנים פולשים, שיפורים גדולים הושגו מאז מיקרוסקופ האלקטרונים ההילוכים (TEM) מבוסס מחקרים של שנתי ה -1980 המאוחרות 4,5. לדוגמה, בשיטות המבוססות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות צבעים, נוגדנים נגד מרכיבי משטח חיידקים, או סמנים לשיתוף לוקליזציה עם תאי subcellular השתלטו על 6,7. עם זאת, הם עדיין לא יניבו רזולוציה spatiotemporal מדויקת וחוסן למדוד קרע vacuolar על ידי חיידקים פתוגנים כמותית.
המשוכה הזאת כבר התייחסה עם assay המבוסס על כתב צפלוספורין נגזר CCF4-AM סריג ששמש לראשונה ללמוד ביטוי גנים 8. ואז, זה היה בשימוש בהקשר של infהביולוגיה ection לחקור הפרשת מפעיל ולעקוב אחרי הספיגה של Neisseria לתוך תאי מארח 9,10,11. פיתחנו assay ניצול של הכתב הזה ללימוד קרע vacuolar הנגרם על ידי Shigella 12 flexneri וMycobacterium tuberculosis 17. העיקרון של שיטתנו מתואר באיור 1 באמצעות Shigella flexneri. ראשית, תאי מארח נטענים עם מצע סריג CCF4-AM כי הוא לכוד בתוך הציטופלסמה לאחר ביקוע את moieties אסתר AM. לאחר מכן, תאים נגועים בShigella flexneri. הווה β-lactamase על פני השטח של החיידקים הוא מסוגל לבקע את מצע CCF4 הקדם קרע vacuolar מתרחש. זה מוביל לאובדן של סריג אות מיתוג שיא הפליטה מ535 ננומטר ל -450 ננומטר על עירור של החללית ב 405 ננומטר. מדידת ratiometric של 450/535 ננומטר העוצמות מדגישה יושרת vacuolar: יחסים נמוכים משקפים קרום-enחיידקים סגורים או תאיים ואילו יחס גבוה משקפים קשר בין החיידקים וcytosol המארח. כמו כן, אנו מדווחים על התאמה של שיטה זו ללימוד קרע phagosomal הנגרם על ידי Mycobacterium tuberculosis במקרופאגים-THP 1. העקרונות הניסיוניים יישארו זהים למרות שההסדר מתהפך, וטוען CCF4-AM מתבצע רק לאחר זיהום חיידקים.
לכן, על ידי מדידות הקרינה ratiometric כמותיים ברמת התא הבודד, קרע vacuolar של Shigella flexneri ניתן לעקוב בזמן אמת ובדגימות קבועות מסוגי תאים שונים 12,13,14. יתר על כן, בשיטה זו ניתן להתאים למספר פתוגנים פולשניות אחרים, כפי שמוצג במחקר זה באמצעות Mycobacterium בוביס ושחפת Mycobacterium. לבסוף, המזעור של הפרוטוקול שלנו ל96 גם (או 384 גם) פורמטים מאפשר הקרנה של מספר רב של תנאים בתפוקה גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay CCF4-AM/β-lactamase הוא שיטה פשוטה כדי לעקוב אחר שיבוש vacuolar תאי הנגרם על ידי Shigella flexneri וmycobacteria בתאים מסוגים שונים. זה עושה שימוש בכתב סריג שהוא ביקע ידי אנזים פעיל על פני השטח של החיידקים רגיש cytoplasmic lactamase.
אובדן של מצע CCF4-AM יכול בקלות להימנע על ידי הוספת probenecid לכל פתרונות לאחר הטעינה של המצע. כפי שהוכח, assay יכול להיות מותאם לסוגי תאים מרובים (תאי אפיתל, תאי phagocytic) ותבניות (96 טובים, 35 מנות תחתיות זכוכית מ"מ, 6/12/24 גם צלחות). לשימוש ב6/12/24 הצלחת היטב, coverslips סטריליים מופצות בתחתית כל היטב לפני זריעת התאים. בסופו של הניסוי, coverslips מועברות בשקופיות בהרכבה בינונית, כמו להאריך את מגיב Antifade זהב (Invitrogen). בדרך זו האות היא יציבה לפרקי זמן ארוכים יותר לאחר assayבהשוואה לפורמט 96 הבארות שבו דגימות נשמרות בPBS לאחר קיבוע. העלות הגבוהה של מצע CCF4-AM צריכה להילקח בחשבון לפני קביעת נפח הדגימה. זו הסיבה שאנחנו ממליצים על קנה מידה במורד אותם. ניסויים יקרים יותר ב6/12/24 פורמט היטב, אך את האותות הם יציבים במשך ימים. אדרבה, ניסויים הם זולים יותר בפורמט גם 96, אבל דגימות צריכים להיות מנותחות ביום של הניסוי. ראוי לציין כי גם ניתן לבצע ניסויים בחיות גם 96 או 384 פורמט היטב. זה מאפשר ביצוע ניסוי חי באמצעות עשרות תנאים באותו הזמן (חיידקים שעברו מוטציה, מוי, transfection פלסמיד או siRNA, כימיקלים וכו ') עם מספרים של עמדות בכל טוב. אמנם מתאים לShigella flexneri, אנו מדגישים כי בזמן אמת "אמיתי" או ניסויי זמן לשגות הם לא ריאלי עבור מחקרי mycobacteria מאז מחזור הזיהום עולה על ריכוזים מדידים של CCF4 שיכול להישמר בcytosol. עבורמהסיבה זו, מצע CCF4-AM מוחל על תאים רק לאחר הפלישה מושגת.
במקרה תוכנת MetaMorph משמשת לרכישה והניתוח, אנו ממליצים להשתמש ב" רכישת המסך "מודול המאפשר רכישת צלחת גם כל 96/384 עם מספר מסוים של תמונות בכל טוב. יתר על כן, "נתוני מסך הסקירה" מודול מאפשר (אני) לדמיין את תמונת הפסיפס של כל התפור היטב לכל ערוץ באותו הזמן על "המפרסם" גדול וכן (ii) לולאת אלגוריתם מיוחד למדידת העוצמות וב535 את 450 ערוצי ננומטר. למרות, שהצלחנו למדוד קרע vacuolar על ידי חיידקים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות, ברצוננו להזהיר כי הפעילות האנזימטית על פני השטח של חיידקים בודדים משתנה טיוח זה קשה בדיוק לתאם מספר החיידקים והיעילות של vacuolar תאיים קרע.
בהתחשב בחוסן של assay, זה מתאים לשעותתפוקת igh מתקרבת ב96 או 384 פורמטים כן. יש לנו גם להתאים בהצלחה בפרוטוקול זה לניתוח FACS ללמוד את הזיהום של תאים בתרחיף 16. Assay יכול לשמש גם לחקירה של חיידקים או לנושאים אחרים המציגים lactamase על פני השטח שלהם, מה שמוביל למגוון רחב של יישומים. לדוגמה, ניתן להשתמש בגישה זו כדי ללמוד קרע vacuolar הנגרם על ידי פתוגנים אחרים כגון β-lactamase להביע Legionella pneumophila, חיידקי ליסטריה או סלמונלה typhimurium 12. מאז יש לו חיידקי ליסטריה מחזור זיהום קצר להשוות Shigella flexneri, ניסויי זמן לשגות הם אפשרי. בניגוד לכך, כי Legionella pneumophila ומחזורים ארוכי זיהום סלמונלה typhimurium תצוגה, אנו ממליצים לבצע ניסויי נקודת סיום.
מגוון רחב של יישומים אפשריים הופך את assay CCF4-AM/β-lactamaseשיטת fluorometric מעניינת למעקב קרע vacuolar הנגרם על ידי פתוגנים תאיים בדגימות קבועות או בזמן אמת.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי סוכנות הידיעות Nationale pour la משוכלל ונדיר ועל ידי מועצת המחקר האירופית.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
