JoVE Journal > Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Simples mesures de cellules de rupture Vacuolar causées par des pathogènes intracellulaires

Published: June 12, 2013
doi:
10.3791/50116
, , , , , ,
1Dynamique des Interactions Hôte Pathogène,Institut Pasteur, Paris, France, 2Imagopole,Institut Pasteur, Paris, France, 3Pathogenomique Mycobacterienne Integrée,Institut Pasteur, Paris, France

Summary

Nous décrivons une méthode pour le suivi de la rupture endomembranaire provoquée par les bactéries intracellulaires<em> Shigella flexneri<em></em</em> Et<em<em><em> Mycobacterium tuberculosis</em></em</em> De l'invasion de la cellule hôte. Notre analyse fait usage de CCF4, une foule cytoplasmique FRET sonde dans des cellules vivantes ou fixe. Ce rapporteur est dégradée par une activité enzymatique présente sur la surface bactérienne.

Abstract

Shigella flexneri sont des bactéries pathogènes qui envahissent les cellules hôtes qui entrent dans une vacuole d'endocytose. Par la suite, la rupture de ce compartiment membrane-clos permet aux bactéries de se déplacer dans le cytosol, proliférer et envahir davantage les cellules voisines. Mycobacterium tuberculosis est phagocyté par les cellules immunitaires, et a récemment été démontré que la rupture membrane du phagosome dans les macrophages. Nous avons développé un test robuste pour le suivi de rupture de la membrane du phagosome après l'entrée de la cellule hôte de Shigella flexneri ou Mycobacterium tuberculosis. L'approche fait usage de CCF4, un journaliste FRET sensibles aux β-lactamase qui s'équilibre dans le cytosol des cellules hôtes. Lors de l'invasion de cellules hôtes par les bactéries pathogènes, la sonde reste intact aussi longtemps que les bactéries se trouvent dans les compartiments de la membrane à l'état libre. Après interruption de l'activité vacuole, β-lactamase à la surface des clive pathogène intracellulaire CCF4 entraîner instantanémentrelative à une perte de signal de commutation FRET et son spectre d'émission. Ce test quotientométrique robuste donne des informations précises sur le moment de la rupture vacuolaire induite par les bactéries envahissantes, et il peut être couplé à la microscopie automatisée et traitement de l'image par des algorithmes spécialisés pour la détection des signaux d'émission du FRET donneur et accepteur. En outre, il permet l'étude des dynamiques de perturbation vacuolar provoquée par des bactéries intracellulaires en temps réel dans des cellules individuelles. Enfin, il est parfaitement adapté à l'analyse à haut débit avec une résolution spatio-temporelle dépassant les méthodes précédentes. Ici, nous fournissons les détails expérimentaux de protocoles exemplaires pour le test de rupture CCF4 vacuole des cellules HeLa et THP-1 macrophages pour des expériences time-lapse ou des points d'expériences finaux utilisant Shigella flexneri ainsi que de multiples souches mycobactériennes telles que Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, et Mycobacterium tuberculosis.

Introduction

De nombreux agents pathogènes bactériens sont internalisés dans les compartiments membraneux des cellules eucaryotes au cours de leur évolution de l'infection. entrée cellulaire se produit soit par phagocytose par les cellules hôtes spécialisées, comme c'est le cas pour Mycobacterium tuberculosis qui sont ingérés par les macrophages ou les agents pathogènes induisent activement leur absorption dans les cellules généralement non-phagocytaires. Dans le cas de l'absorption induite, par exemple pour Shigella flexneri, l'agent pathogène injecte des protéines effectrices dans le cytosol hôte que détourner parmi d'autres fonctions cellulaires de la machines de tri endomembranaire étroitement régulée résultant de la localisation bactérienne dans un 1,2 compartiment endosomal. Par la suite, Shigella perturbe la membrane enfermant conduisant à une rupture vacuolaire et l'accès cytosolique de l'agent pathogène interférer avec le trafic membranaire d'accueil et d'éviter la livraison vers le lysosome. Plus récemment, la rupture phagolysosomique a également été constaté que str infectionatégie utilisé par Mycobacterium tuberculosis, un agent pathogène que l'on croyait depuis longtemps d'être localisée exclusivement dans un compartiment membranaire 3,17.

Pour étudier la dynamique du trafic membranaire subcellulaire des agents pathogènes envahissants, de grands progrès ont été accomplis depuis la microscopie électronique en transmission (TEM) sur la base des études de la fin des années 1980 4,5. Par exemple, les méthodes à base de microscopie par fluorescence utilisant des colorants, des anticorps contre les composants de surface des bactéries ou des marqueurs de co-localisation avec des compartiments sous-cellulaires ont repris 6,7. Cependant, ils n'ont toujours pas donné la résolution et la robustesse de mesurer rupture vacuolar par des pathogènes bactériens quantitative spatio-temporel précis.

Cet obstacle a été traitée avec un dosage basé sur le journaliste dérivé CCF4-AM FRET céphalosporines qui a été d'abord utilisé pour étudier l'expression des gènes 8. Ensuite, il a été utilisé dans le contexte de infbiologie ection d'enquêter sécrétion effecteur et de suivre l'adoption de Neisseria dans des cellules hôtes 9,10,11. Nous avons développé un test en profitant de ce journaliste pour l'étude de la rupture vacuolaire induite par Shigella flexneri 12 et Mycobacterium tuberculosis 17. Le principe de notre méthode est décrite dans la figure 1 à l'aide Shigella flexneri. Tout d'abord, les cellules hôtes sont chargés avec le substrat CCF4-AM FRET qui est piégée à l'intérieur du cytoplasme après on élimine les groupements de type ester AM. Ensuite, les cellules sont infectées par Shigella flexneri. β-lactamase présente sur la surface de la bactérie est capable de cliver le substrat dès que la rupture se produit CCF4 vacuolaire. Cela conduit à une perte de signal de FRET de commutation du pic d'émission de 535 nm à 450 nm lors de l'excitation de la sonde à 405 nm. La mesure de quotient des intensités 450/535 nm met en évidence l'intégrité vacuolar: faibles ratios reflètent membrane-enbactéries fermés ou extracellulaire, alors que des ratios élevés reflètent contact entre les bactéries et le cytosol hôte. Nous présentons également une adaptation de cette méthode pour l'étude de rupture du phagosome induite par Mycobacterium tuberculosis dans les macrophages THP-1. Les principes expérimentaux restent les mêmes, mais la séquence est inversée, CCF4-AM chargement est appliqué seulement après l'infection bactérienne.

Ainsi, par des mesures de fluorescence ratiométriques quantitatives au niveau de la cellule unique, la rupture vacuolaire de Shigella flexneri peut être suivi en temps réel et dans des échantillons fixes de différents types de cellules 12,13,14. En outre, cette méthode peut être adaptée à un certain nombre d'autres agents pathogènes envahissants comme le montre cette étude en utilisant Mycobacterium bovis et Mycobacterium tuberculosis. Enfin, la miniaturisation de notre protocole de 96 puits (ou 384 puits) formats permet le criblage de nombreuses conditions à haut débit.

Protocol

Le test fonctionne dans différents formats, mais nous recommandons révision à la baisse du volume d'échantillon pour sauver réactifs, en particulier CCF4-Am. Par conséquent, le protocole suivant est décrit pour les cellules HeLa fixes ou THP-1 des cellules de type macrophage dans un format de 96 puits, puis pour les cellules HeLa vivantes en 35 mm plats à fond de verre. Le dosage peut être adapté à d'autres agents pathogènes. Outre la shigellose, nous décrivons le dosage pour phagocyter différentes souches y cobacterial THP-1 m. Surtout, après CCF4-AM chargement, tous les réactifs et tampons dont tampons de lavage nécessitent la présence de probénécide à 1 mM. Probénécide est un inhibiteur des canaux d'anions qui favorise la rétention cytosolique de CCF4 dans toutes les étapes du protocole. Échantillons fixes devraient être acquises au bout de quelques heures après l'expérience puisque le signal CCF4 n'est pas stable pour de longues périodes. 1. CCF4 test sur ​​des échantillons fixes utilisant des Shigella flexneri (96 puits) Préparation des bactéries pour cultures de la nuit. Inoculer les bactéries pré-cultures de type sauvage (M90T AfaI) et mutantes (BS176 AfaI) souches 1 jour avant l'infection dans 8 ml tryptique de caséine soja bouillon (TCSB) additionné d'ampicilline (50 pg / ml) dans un shaker à 37 ° C pendant la nuit . étalement des cellules à l'infection. Des cellules HeLa de semences plaques à 96 puits 1 jour avant l'infection à une densité de 5 x 10 3 cellules par puits dans du DMEM contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS) et 1% de pénicilline-streptomycine dans un 5% de CO 2 incubateur dans un volume final de 100 pi. Dans le cas des cellules THP-1 de type macrophage, le placage de la cellule se fait 2 jours avant l'infection à une densité de 5 x 10 4 cellules / puits, et ils sont incubés avec 30 nM acétate de phorbol myristate (PMA) dans du milieu RPMI contenant 10% sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine et 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol. Préparation des bactéries pour les repiquages. Inoculer des cultures bactériennes nuità une dilution de 1/100 à TCSB additionné de 50 pg / ml d'ampicilline, dans un agitateur à 37 ° C pendant 2,5 heures (DO600 = 0,3 à 0,4). Chargement des piles avec CCF4-AM. Préparer le mélange CCF4-AM de chargement pour un volume final de 25 pi par puits contenant 1 mM de probénécide (Sigma), 1,5 uM CCF4-AM (6 M dans le cas des THP-1) et 1,25 pi de solution de chargement B (100 mg / ml Pluronic-F127 tensioactif dans l'acide acétique DMSO/0.1% prévu le long CCF4-AM LiveBlazer Kit Chargement par Invitrogen) dans EM tampon (NaCl 120 mM, 7 mM de KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM de glucose, HEPES 25 mM à pH 7,3). Laver les cellules une fois avec du PBS et ajouter 25 ul de CCF4-AM mélange chargement par puits à température ambiante dans l'obscurité pendant 2,5 heures. Préparation des bactéries d'infection. Spin 1 ml de sous-cultures bactériennes à 9000 rpm pendant 1 min. Laver une fois avec 500 pi de PBS, rotation à 9000 rpm pendant 1 min et remettre en suspension dans 500 pi de PBS additionné de 10 pg / ml de poly-L-lysine (Sigma) et 40 pg / ml de β-Lactamase (Sigma). Après 10 min d'incubation sur une roue tournant à température ambiante, laver une fois avec 500 pi de PBS et les bactéries remettre en suspension dans 500 pi de tampon EM / 1 mM probénécide. infection de cellules et la fixation. Laver les cellules une fois avec 150 pi de PBS / 1 mM probénécide, préparer un mélange de 10 ul de bactéries remises en suspension dans un volume final de 100 ul de tampon EM / 1 mM de probénécide et de le distribuer à chaque puits. Après 15 minutes d'incubation dans l'obscurité, à température ambiante, mettez la plaque à 37 ° C pendant 1 heure (90 min dans le cas des THP-1), laver avec 150 pi de PBS / 1 mM de probénécide et de fixer avec 50 paraformaldéhyde pi 4% / 1 mM probénécide pendant 10 minutes dans l'obscurité. Ensuite, lavez avec 150 pi de PBS / 1 mM probénécide, incuber pendant 30 min avec 30 ul de 10 uM noyaux colorant DRAQ5 (Biostatus), laver avec 150 pi de PBS / 1 mM de probénécide et de laisser les échantillons dans 100 pi de PBS / 1 mM probénécide. paramètres d'acquisition des échantillons fixés. L'acquisition est réalisée en utilisant soit (i) un micros épifluorescence inverséface à un 20x (0,5 Ouverture numérique (NA), 2,1 Distance de travail (WD)) ou 40x (NA 0,75, 0,72 WD) N-plan objectif air ou (ii) à l'aide d'un microscope confocal avec un objectif 10x. L'imagerie par fluorescence est effectuée avec une excitation à 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) et l'émission détectée par 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) et des filtres 535 nm (Semrock, FF01-520/35- 25) avec des temps d'exposition de 5 ms (lumière transmise), 1000 msec (535 nm) et 500 ms (450 nm). Imagerie confocale est effectuée en utilisant le temps d'exposition qui suit: 240 ms (450 nm) et 360 ms (535 nm) pour le laser à 405 nm (870 mW), 640 ms (DRAQ5) pour le laser à 640 nm (2 560 mW). Une analyse post-acquisition. Par la suite, les images sont analysées par un algorithme informatique qui permet à marquer automatique du signal de fluorescence pour chacun des cellules individuelles. Des logiciels tels que Metamorph 7.1 ou Acapella peut être utilisé pour créer un script permettant de mesurer le rapport entre les signaux d'émission 450nm et 535nm (disponible sur demande). Il faut noter que l'utilisation d'un dispositif de calibrage de focalisation couplée à la microscopie automatisée lors de l'acquisition permet l'acquisition de plusieurs dizaines de positions différentes dans des puits multiples dans le même temps. 2. CCF4 test sur ​​des échantillons en direct en utilisant Shigella flexneri (35 mm Format à fond de verre, MatTek) Préparation des bactéries pour cultures de la nuit. Procédez comme décrit précédemment. étalement des cellules à l'infection. Des cellules HeLa de semences dans 35 boîtes de culture à fond de verre mm (10 mm MatTek Microwell, société MatTek) 1 jour avant l'infection à une densité de 2 x 10 5 cellules / boîte dans un volume final de 2 ml. Préparation des bactéries pour les repiquages. Procédez comme décrit précédemment. Chargement des piles avec CCF4-AM. Préparer le mélange chargement CCF-AM comme décrit précédemment pour un volume final de 2 ml par boîte. Avant le chargement, laver les cellules une fois avec du PBS. Préparation des bactéries d'infection. Procédez comme décrit précédemment. Acquisitles paramètres d'ions d'échantillons vivants. L'acquisition est réalisée pendant 60 min toutes les 90 secondes avec un microscope à épifluorescence inversé en utilisant un 20x (0,5 NA, 2.1 WD) ou un (NA 0,75, 0,72 WD) L'objectif de l'air N-Plan 40x dans un ° C chambre de chauffage 37. L'imagerie par fluorescence est effectuée avec une excitation à 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) et l'émission détectée par 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) et des filtres 535 nm (Semrock, FF01-520/35- 25) avec des temps d'exposition de 5 ms (lumière transmise), 200 ms (535 nm) et 100 ms (450 nm). infection cellulaire et acquisition en direct. Laver les cellules une fois avec 2 ml de PBS / 1 mM probénécide, ajouter 2 ml de EM / 1 mM probénécide, monter le plat sur la platine du microscope et lancer l'acquisition. Après 6 min (point 4 temps), a mis l'acquisition en attente, ajouter 250 microlitres de bactéries remise en suspension au-dessus des cellules et redémarrez l'acquisition. Une analyse post-acquisition. Les films peuvent être visualisés à l'aide Metamorph ou ImageJ. 450/535 ratios d'intensité nm pour chaque individouble cellule peut être obtenue en utilisant ImageJ. Comme mentionné précédemment, l'utilisation d'un dispositif d'étalonnage de mise au point couplée à la microscopie automatisée lors de l'acquisition permet d'acquérir plusieurs positions différentes en fonction du time-lapse. 3. CCF4 test sur des échantillons fixe à l'aide Mycobactéries (96 Format Well) Préparation des bactéries. Croître souches de mycobactéries à la phase semi-log en 7H9 contenant du dextrose albumine catalase (ADC) à 30 ° C (par Mycobacterium marinum) ou 37 ° C (par Mycobacterium bovis BCG et Mycobacterium tuberculosis). étalement des cellules à l'infection. Plate THP-1 macrophages 2 jours avant l'infection en les incubant avec 30 nM PMA dans RPMI contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS), 1% de pénicilline-streptomycine et 0,05 mM de 2-mercaptoéthanol à 5% de CO 2 incubateur dans un volume final de 100 pl à une densité de 5 x 10 4 cellules / puits. Préparation des bactéries d'infection. Harvcultures HNE, laver et remettre en suspension avec du PBS avant sonication et filtration à travers une seringue afin d'éviter les grumeaux. Déterminer la concentration de chaque souche par DO600 mesure et infecter les cellules THP-1 à une MOI de 1:1 à 30 ° C (par Mycobacterium marinum) ou 37 ° C (par Mycobacterium bovis BCG et Mycobacterium tuberculosis) dans un milieu RPMI avec 5% CO 2. Après 2 heures, éliminer le milieu, laver 3 fois avec du PBS et ajouter du milieu frais complète pour 1 à 2 jours (dans le cas de Mycobacterium marinum) ou 3 à 7 jours (dans le cas de Mycobacterium bovis BCG et Mycobacterium tuberculosis). Chargement cellules avec CCF4-AM et la fixation. Laver les cellules une fois avec du PBS et préparer le mélange CCF4-AM chargement comme décrit précédemment pour un volume final de 25 pi par puits en utilisant une concentration finale CCF4-AM de 6 pm. Chargement en cours a lieu à la température ambiante dans l'obscurité pendant 2 heures avant de le laver avec 150 pi probénécide PBS / 1 mM et de fixeration en utilisant 50 ul paraformaldéhyde à 4% complété with1 mM probénécide pendant 30 minutes dans l'obscurité. Ensuite, lavez avec 150 pi de PBS / 1 mM de probénécide et de laisser les échantillons dans 100 pi de PBS / 1 mM probénécide. paramètres d'acquisition et d'analyse post-acquisition. Procédez comme précédemment décrit dans le premier paragraphe en utilisant Shigella flexneri. Protocole complémentaire Dosages par fluorimétrie sont effectués afin de vérifier l'activité β-lactamase à la surface des bactéries. Cela devrait être fait pour chaque souche bactérienne destiné à être utilisé dans le test décrit. A cet effet, les bactéries lavées sont mis en contact avec 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 pg / ml porcine extraits de foie d'estérase (sigma) dans 1 ml de PBS pendant 1 heure à 37 ° C dans l'obscurité. Soluble lactamase 1 mg / ml (Invitrogen) peuvent être utilisés comme témoin positif. Ensuite, une analyse de l'émission est réalisée à l'aide d'une excitation 405nm Quantamaster fluorimeter PTI et 1 ml quartz cuvette. La perte de FRET à 535 nm et l'apparition d'un pic de haute nm 450 sont visualisés sur les bactéries plus de la sonde CCF4.

Representative Results

L'approche CCF4-AM/β-lactamase est une méthode robuste et sensible pour repérer rupture vacuolaire des pathogènes intracellulaires tels que Shigella flexneri (Figure 1). Les souches de Shigella qui sont utilisés dans cette étude sont appelés M90T AfaI et BS176 AfaI. M90T AfaI est une souche de Shigella flexneri qui exprime l'adhésine afae, qui est capable de se lier efficacement CD55 à la surface des cellules épithéliales 15. Souches exprimant donc afae affichent des capacités d'invasion beaucoup plus élevés par rapport à la souche M90T sauvage dans les cellules épithéliales. BS176 AfaI est un afae exprimer mutant Shigella flexneri souche dépourvue de la virulence de Shigella plasmide. Cette souche est incapable d'envahir les cellules HeLa. Néanmoins, cette souche est capable de pénétrer dans les cellules THP-1 depuis l'adoption de cette lignée cellulaire repose uniquement sur la phagocytose classique et ne nécessite pas un système de type 3 sécrétion fonctionnel. Les deux souches expriment β-lactamase, Et présentent une activité β-lactamase à leur surface en raison de la présence du plasmide codant afae. Lors de l'infection des cellules HeLa par la souche non invasive BS176 AfaI pendant 1 heure, la sonde FRET CCF4 reste intact, comme représenté sur la figure 2A par le signal vert (535 nm). Au contraire, l'infection par la souche virulente M90T AfaI pendant 1 heure conduit à un commutateur de signaux vers le bleu (450 nm) en soulignant le clivage de la sonde dans le cytosol. Afin de quantifier cela, nous avons développé un script pour le logiciel Metamorph et Acapella qui permet la détection automatisée des cellules et la mesure de l'intensité dans les canaux 535 et 450 nm pour la détermination du signal radiométrique. Comme le montre la figure 2B, les noyaux et cytosol des cellules sont segmentés en utilisant le canal DRAQ5. Ensuite, l'algorithme est capable de détecter les 450 nm et les populations de cellules positives de 535 nm pour calculer le rapport entre les deux intensités pour chaque cellule individuelle qui estreprésenté sous forme d'histogramme sur la figure 2C. Faibles ratios sont obtenus pour la souche mutante par rapport à des ratios élevés de la souche virulente. Bien que cette expérience d'infection représentant a été acquis en utilisant la microscopie confocale, microscopie à épifluorescence est également adapté pour cette tâche figures 3 et 4 montrent des exemples à l'aide de 2 types de cellules humaines différentes:. Cellules épithéliales HeLa et THP-1 des cellules de type macrophage. Lors de l'infection par la souche virulente M90T AfaI Shigella pendant 1 h et 90 min pour les cellules HeLa et THP-1, un commutateur de signal du vert (535 nm) au bleu (450 nm) est observée par rapport à BS176 cellules infectées AFAI (figures 3A et 4A). Le script que nous avons développé le logiciel MetaMorph détecte directement la population positif CCF4 de cellules et de calculer le rapport entre les intensités de 450 et 535 nm pour des canaux de chacune des cellules individuelles. Puis les cellules sont classifiées en fonction de leur rapport en utilisant une macro déveped dans Excel, donnant ainsi des histogrammes montrant la répartition de la cellule. Comme cela a été le cas pour l'autre scénario développé pour Acapella, BS176 cellules infectées AFAI se caractérisent par de faibles ratios, tandis que les cellules infectées AfaI M90T affichent des ratios élevés en utilisant l'algorithme MetaMorph sur les cellules HeLa et les macrophages THP-1 (figures 3B et 4B) . Enfin, une adaptation de cette méthode pour l'étude des mycobactéries est illustré à la figure 5. Mycobacterium bovis BCG réside dans le phagosome pour toute la durée de l'expérience, comme en témoigne le signal nm 535 forte détectée tout au long de la durée de l'expérience. En revanche, Mycobacterium tuberculosis provoque la rupture de la membrane du phagosome dans les macrophages THP-1 après plus de 3 jours de l'infection, comme le souligne par un signal de 450 nm à 7 jours après l'infection (figure 5A et 5B). En utilisant le même algorithme que pour l'étude de la rupture vacuolar par Shigella </em>, nous avons constaté que les cellules infectées par Mycobacterium tuberculosis présentent des ratios plus élevés 450/535 nm que Mycobacterium bovis BCG après 7 jours de l'infection (figures 5C et 5D). Figure 1. Schéma représentant le principe du dosage CCF4-AM/β-lactamase pour suivre Shigella flexneri vacuolaire rupture. CCF4-AM diffuse librement à travers la membrane plasmique vers le cytoplasme où groupements ester sont clivés par les estérases cytosoliques produisant CCF4 anions. Cette réaction empêche CCF4 d'entrer dans une membrane du compartiment intégré. À cette étape, CCF4 suscite FRET à 535 nm après excitation à 405 nm. La sonde reste intact jusqu'à ce que les bactéries exprimant des β-lactamases rupturE, la vacuole d'endocytose. À cette étape, le signal de FRET est perdue parce que CCF4 est clivée par β-lactamase déclencher un interrupteur dans l'émission de 535 nm à 450 nm après excitation à 405 nm. Figure 2. Suivi Shigella flexneri vacuolar rupture en utilisant la microscopie confocale. (A) après 2 h 30 min de CCF4-AM chargement, cellule HeLa sont infectées par la souche flexneri BS176 β-lactamase exprimer Shigella AfaI mutant ou le AfaI souche virulente M90T pendant 1 heure et fixe en utilisant du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min. Puis, les noyaux sont colorés avec DRAQ5 et les cellules sont imagées à l'aide d'un microscope confocal avec un objectif 10x. Photos représentatives ont été choisies avec les chaînes fusionnées suivants: la sonde intacte CCF4 apparaît à 535 nm (degrén), la sonde clivée CCF4 apparaît à 450 nm (bleu). (B) Exemples de photos mettant en évidence le système de détection de notre algorithme automatisé du logiciel Acapella. La segmentation des noyaux des cellules (+ cytosol) est obtenu en utilisant le canal DRAQ5. CCF4 cellules positives sont obtenues en utilisant les canaux 450 et 535 nm regroupées ensemble. (C) Histogramme montrant le résultat de notre analyse automatisée sur Acapella utilisant Shigella flexneri BS176 AfaI souche mutante ou M90T AfaI souche virulente. Le ratio moyen représente le rapport entre l'intensité dans les canaux 450 et 535 nm. Cliquez ici pour agrandir la figure . Figure 3. Suivi Shigella flexneri vacuolar rupture dans les cellules HeLa en utilisant la microscopie à épifluorescence. (A) après 2 h 30 min de CCF4-AM chargement, les cellules HeLa sont infectées par la souche flexneri BS176 β-lactamase exprimer Shigella AfaI mutant ou le AfaI souche virulente M90T pendant 1 heure et fixé à l'aide du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min. Ensuite, les cellules sont imagées par un microscope à épifluorescence avec un objectif 20x. Photos représentatives ont été choisies pour les chaînes suivantes:. CCF4 intact sonde 535 nm (vert) et CCF4 clivés sonde 450 nm (bleu) (B) histogramme représentant le résultat de notre analyse automatisée des logiciels MetaMorph. Les cellules individuelles sont répartis en fonction de leur rapport des intensités dans les canaux 450 et 535 nm. <br / > Figure 4. Suivi Shigella flexneri vacuolar rupture dans les cellules THP-1 en utilisant la microscopie à épifluorescence. (A) après 2 h 30 min de CCF4-AM chargement, cellules THP-1 sont infectées par le flexneri BS176 souche β-lactamase exprimer Shigella AfaI mutant ou le M90T AfaI souche virulente pendant 1 h 30 min et fixe à l'aide du paraformaldéhyde 4% pendant 10 min. Ensuite, les cellules sont imagées par un microscope à épifluorescence avec un objectif 20x. Photos représentatives ont été choisies pour les chaînes suivantes:. CCF4 intact sonde 535 nm (vert) et CCF4 clivés sonde 450 nm (bleu) (B) histogramme représentant le résultat de notre analyse automatisé en utilisant le logiciel MetaMorph. Les cellules individuelles sont répartis en fonction de leur rapport des intensités dans les canaux 450 et 535 nm. ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/> Figure 5. Suivi Mycobacterium bovis BCG et Mycobacterium tuberculosis rupture phagosome dans les macrophages THP-1 en utilisant la microscopie à épifluorescence. (A, B) cellules THP-1 sont infectées par le β-lactamase exprimer Mycobacterium bovis BCG ou Mycobacterium tuberculosis pendant 2 heures et cultivées pendant 3 à 7 jours . Après lavage, les cellules sont chargées avec CCF-4-AM pendant 2 heures et fixe à l'aide du paraformaldéhyde 4% pendant 30 min avant d'imagerie utilisant un microscope à épifluorescence avec un objectif 40x. Photos représentatives ont été choisies avec les canaux suivants: intact CCF4 sonde, 535 nm (vert); clivé CCF4, la sonde 450 nm (bleu) (C, D) histogrammes présentant les résultats de notre analyse automatisée en utilisant un logiciel MetaMorph.. Les cellules individuelles sont réparties en fonction du rapport entre l'intensité dans les canaux 450 et 535 nm.

Discussion

Le test CCF4-AM/β-lactamase est une méthode simple pour suivre les perturbations vacuolaire induite par Shigella flexneri intracellulaire et les mycobactéries dans différents types cellulaires. On fait usage d'une lactamase sensible cytoplasmique reporter FRET qui est clivé par une enzyme active à la surface de la bactérie.

Perte du substrat CCF4-AM peut facilement être évité en ajoutant probénécide à toutes les solutions après le chargement du substrat. Comme l'a démontré, le dosage peut être adapté à plusieurs types de cellules (cellules épithéliales, les cellules phagocytaires) et des formats (96 puits, 35 mm plats à fond de verre, plaques 6/12/24 puits). Pour l'utilisation de la plaque de puits 12/06/24, lamelles stériles sont distribués au fond de chaque puits avant l'ensemencement des cellules. A la fin de l'expérience, les lamelles sont transférées sur des lames en milieu de montage, comme Prolongez réactif Antifade Gold (Invitrogen). Le signal de cette façon est stable pour des périodes de temps plus longues après le testpar rapport au format 96 puits où les échantillons sont conservés dans du PBS après fixation. Le coût élevé du substrat CCF4-AM doit être pris en compte avant de déterminer le volume de l'échantillon. C'est pourquoi nous vous recommandons de les réduisant. Les expériences sont plus chers en 6/12/24 format bien mais les signaux sont stables pendant des jours. Au contraire, les expériences sont moins chers dans le format 96 puits, mais les échantillons doivent être analysés le jour de l'expérience. Il est à noter que les expériences vivantes peuvent également être effectués au puits format 96 ou 384 puits. Ceci permet d'effectuer l'expérience en direct à l'aide des dizaines de conditions en même temps (bactéries mutantes, IAM, la transfection du plasmide ou siRNA, les produits chimiques, etc) avec les nombres de positions par puits. Bien adapté à Shigella flexneri, nous soulignons que le temps «vrai» réel ou expériences time-lapse sont pas réalisables pour des études mycobactéries depuis le cycle d'infection dépasse concentrations mesurables de CCF4 qui peuvent être retenus dans le cytosol. PourC'est pourquoi, le substrat CCF4-AM est appliquée sur les cellules seulement après l'invasion est atteint.

Dans le cas où le logiciel MetaMorph est utilisé pour l'acquisition et l'analyse, nous recommandons d'utiliser le module "acquisition de l'écran» qui permet l'acquisition de l'ensemble d'une plaque et 96/384 avec un certain nombre de photos par puits. En outre, les «données d'écran d'examen" module permet (i) la visualisation de l'image mosaïque cousu de chaque bien pour n'importe quel canal en même temps sur un grand "poster" et (ii) en boucle un algorithme spécialisé pour mesurer les intensités dans le 535 et les canaux à 450 nm. Même si, nous avons pu mesurer rupture vacuolar par des bactéries simples en utilisant la microscopie time-lapse, nous tenons à mettre en garde que l'activité enzymatique à la surface des bactéries individuelles varie rend difficile de corréler précisément nombre de bactéries et l'efficacité des vacuoles intracellulaires rupture.

Compte tenu de la robustesse de l'analyse, il est adapté pour hdébit d'aute approches dans 96 ou 384 formats ainsi. Nous avons également réussi à adapter ce protocole pour l'analyse FACS pour étudier l'infection de cellules en suspension 16. Le test peut également être utilisé pour l'étude d'autres bactéries ou des supports présentant lactamase à leur surface, ce qui conduit à un large éventail d'applications. Par exemple, cette approche peut être utilisée pour étudier la rupture vacuolaire induite par d'autres agents pathogènes tels que les β-lactamase exprimer Legionella pneumophila, la bactérie Listeria monocytogenes ou Salmonella typhimurium 12. Depuis Listeria monocytogenes a un cycle d'infection court comparable à Shigella flexneri, des expériences time-lapse sont possibles. En revanche, parce que Legionella pneumophila et Salmonella typhimurium affichage cycles d'infection longs, nous vous suggérons de réaliser des expériences sur le point final.

La variété des applications possibles rend le dosage CCF4-AM/β-lactamase uneméthode fluorimétrique intéressant pour le suivi rupture vacuolaire induite par des agents pathogènes intracellulaires dans des échantillons fixes ou en temps réel.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par l'Agence Nationale pour la Recherche et par le Conseil européen de la recherche.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) Invitrogen K1089 Protect from light, stock in – 80 ° aliquots
Draq5 Biostatus DR50050
Poly-L-lysine Sigma P9155
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well Greiner Bio-One 655090
35 mm glass bottom dishes MatTek corp. P35G-1.5-10-C
Probenecid Sigma P8761
β-lactamase Sigma P0389
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References

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Single CellVacuolar RuptureIntracellular PathogensShigella FlexneriMycobacterium TuberculosisCCF4 FRET ReporterPhagosomal Membrane DisruptionReal-time ImagingHigh-throughput Analysis

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Keller, C., Mellouk, N., Danckaert, A., Simeone, R., Brosch, R., Enninga, J., Bobard, A. Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens. J. Vis. Exp. (76), e50116, doi:10.3791/50116 (2013).
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