Quantitative High-throughput Single-cell Zytotoxizitätstest für T-Zellen
Summary
Wir beschreiben ein Single-Cell-Assay mit hohem Durchsatz, die Zytotoxizität von T-Zellen zu messen, wenn mit Tumor Zielzellen inkubiert. Dieses Verfahren verwendet eine dichte, elastomeren Anordnung von Sub-Nanoliter-Wells (~ 100.000 Wells / Array) räumlich zu begrenzen, die T-Zellen und Zielzellen in definierten Verhältnissen und mit Fluoreszenzmikroskopie gekoppelt Effektor-Target Konjugation und anschließender Apoptose überwachen.
Abstract
Krebs-Immuntherapie bändigen können die Spezifität der Immunantwort zu zielen und zu beseitigen Tumoren. Adoptiven Zelltherapie (ACT), basierend auf den adoptiven Transfer von T-Zellen gentechnisch verändert, um ein chimäres Antigen-Rezeptor (CAR) ausdrücken hat beträchtliches Potential in klinischen Versuchen 1-4 dargestellt. Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung CAR + T-Zellen für die Behandlung von Krebsarten, einschließlich der Fähigkeit, nicht-MHC-beschränkte Antigene gezielt eingesetzt werden und die T-Zellen zur optimalen Überleben, Homing und Persistenz im Wirt zu funktionalisieren, und schließlich, um Apoptose zu induzieren von CAR + T-Zellen bei Wirtstoxizität 5.
Abgrenzung der optimalen Funktionen des CAR + T-Zellen mit klinischen Nutzen zugeordnet ist von wesentlicher Bedeutung für die nächste Generation von klinischen Studien. Jüngste Fortschritte in der lebenden Tier Bildgebung wie Mehrphotonenmikroskopie revolutioniert haben die Studie von Immunzellen Funktion in 6,7 vivo. Während diese Studien unser Verständnis der T-Zell-Funktionen in vivo T-Zell-basierte ACT in klinische Studien haben vorgeschoben erfordert die Notwendigkeit, die molekularen und funktionellen Eigenschaften der T-Zell-Zubereitungen Vorinfusionsleitung mit klinischen Wirksamkeit Nachinfusionsleitung verknüpfen, durch Verwendung in vitro-Assays überwacht T-Zell-Funktionen wie, Zytotoxizität und Zytokinsekretion. Standard Durchflusszytometrie basierende Assays entwickelt worden, bestimmen die allgemeine Funktionsweise von Populationen von T-Zellen in der Ebene einzelner Zellen, aber diese sind nicht geeignet für die Überwachung Konjugat Bildung und Leben oder die Fähigkeit der gleichen Zelle zu töten mehrere Ziele 8.
Mikrohergestellte Arrays in biokompatible Polymere wie Polydimethylsiloxan (PDMS) ausgebildet sind ein besonders attraktives Verfahren zur räumlich beschränken Effektoren und Targets in kleinen Mengen 9. In Kombination mit automatisierten Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie, thousands von Effektor-Target-Wechselwirkungen können gleichzeitig durch bildgebende einzelnen Vertiefungen einer nanowell Arrays überwacht werden. Wir stellen hier eine Hochdurchsatz-Methodik zur Überwachung T-Zell-vermittelte Zytotoxizität bei der Einzelzell-Ebene, die weitgehend für die Untersuchung der Funktionalität von cytolytischen T-Zellen angewendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben das Protokoll für ein Hochdurchsatz-Single-Cell-Assay cytolytischen durch Co-Inkubation von Effektoren und Targets in Arrays von nanowells (Abbildung 1) aktiviert skizziert. Neben Durchsatz ein großer Vorteil des Verfahrens ist die Möglichkeit, Effektorzellen-vermittelten Zytotoxizität gegen gewünschten Zielzellen ohne Zielzelle Engineering Dies wiederum erlaubt die Verwendung von autologen oder Matched / primären Tumorzellen als Zielzellen zu überwachen. Die räumliche Begrenzung ermö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter-Award Anzahl R01CA174385 unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
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