يعاير الحمض النووي من التلف في الخلايا العصبية قرن آمون باستخدام مقايسة المذنب
Summary
ومقايسة المذنب هو وسيلة فعالة للكشف عن الانقطاعات منفردة ومزدوجة حبلا، بما في ذلك قلوي قابل للتغيير المواقع وDNA-DNA/DNA-protein عبر وصلات على الحمض النووي في خلايا جميع بما في ذلك الخلايا العصبية قرن آمون. الأسلوب يستفيد من الهجرة التفاضلية من الحمض النووي في المجال الكهربائي بسبب الاختلافات في كمية الحمض النووي من التلف.
Abstract
وهناك عدد من العقاقير تستهدف مسارات إصلاح الحمض النووي وحمل الخلية قتل عن طريق إنشاء الحمض النووي من التلف. وهكذا، تم العمليات مباشرة لقياس الحمض النووي من التلف تقييم على نطاق واسع. الطرق التقليدية وقتا، طويلا مكلفة، وتتطلب موارد كثيفة الخلايا تكرار. في المقابل، ومقايسة المذنب، هلام خلية واحدة مقايسة الكهربائي، هو أسرع وغير الغازية، وغير مكلفة، مقياسا مباشرا وحساسة من الحمض النووي من التلف والإصلاح. يمكن فيها إعمال جميع أشكال الحمض النووي من التلف وكذلك إصلاح الحمض النووي تصور على مستوى خلية واحدة باستخدام هذه التقنية القوية.
والمبدأ الذي يقوم عليه مقايسة المذنب هو أن أمر غاية في حين DNA الحمض النووي من التلف سليمة يعطل هذه المنظمة. ويتسرب DNA التالفة في مصفوفة الاغاروز وعندما تتعرض لمجال كهربائي، وDNA سالبة الشحنة يهاجر نحو القطب السالب الذي موجبة الشحنة. الكبيرة خيوط DNA غير التالفة ليست قادرة على الهجرة بعيدا عن النواة. DNA الضرريخلق شظايا أصغر DNA التي تسافر أبعد من DNA سليمة. المذنب الفحص، وهو برنامج تحليل الصور والتدابير ويقارن شدة الفلورسنت العام للDNA في نواة مع DNA الذي هاجر من النواة. إشارة الفلورسنت من DNA هاجر يتناسب مع الحمض النووي من التلف. أكثر إشراقا يعد الذيل يدل على زيادة DNA الحمض النووي من التلف. بعض المعلمات التي يتم قياسها هي اللحظة التي الذيل هو مقياس لكل من كمية الحمض النووي DNA وتوزيع في الذيل طول الذيل، والنسبة المئوية للDNA في الذيل. يسمح هذا الفحص لقياس إصلاح الحمض النووي وكذلك منذ قرار من الحمض النووي من التلف يعني إصلاح قد حدثت. الحد من الحساسية هو فواصل حبلا نحو 50 في 1،2 مضاعفا خلايا الثدييات. الخلايا تعامل مع أي وكلاء DNA الضارة، مثل إيتوبوسيد، يمكن استخدام كعنصر تحكم إيجابية. وبالتالي مقايسة المذنب هو إجراء سريع وفعال لقياس الحمض النووي من التلف.
Protocol
Discussion
ومقايسة المذنب لديه قدرة فريدة على تحليل الخلايا الفردية. هذا هو مفيد في تحديد المجموعات السكانية الفرعية من الخلايا التي توضح الفرق استجابة للعوامل السامة للخلايا. عدد قليل من القيود العملية يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. قد يكون عدد الخلايا التي يمكن تقييمها بشكل فردي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل على جائزة IMPACT من قسم علاج الأورام بالإشعاع، جامعة ألاباما في برمنغهام مركز السرطان الشامل، ومؤسسة الأطفال مكافحة للسرطان، ومؤسسة غابرييل انجيل (لESY).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| 1.5 ml tubes | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, boric acid, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarose | Sigma | A5093 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Beaker | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV Image Analysis System | ||
| Cylinder | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Electrophoresis chamber | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss Axio Vision | Any fluorescent microscope with green filter will suffice | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Low melting point agarose | Promega | V2111 | |
| Microwave | Sears | ||
| Phosphate buffered saline, calcium free, magnesium free | HyClone | SH3025601 | |
| Power supply | BioRad | 1645050 | |
| Refrigerator | Sears | ||
| Ruler | Staples | ||
| Slide | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Fisher Scientific | S529 | |
| Sybr green | Invitrogen | S7585 | |
| Tray | Fisher Scientific | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Trypsin | HyClone | SH3023601 | |
| Vortex | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Water bath | Fisher Scientific | 154622Q |
References
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology. Mol. Cytogenet. 3, (2010).
- Olive, P. L. The comet assay. An overview of techniques. Methods Mol. Biol. 203, 179-194 (2002).
- Olive, P. L. Detection of DNA damage in individual cells by analysis of histone H2AX phosphorylation. Methods Cell Biol. 75, 355-373 (2004).
- Olive, P. L. Impact of the comet assay in radiobiology. Mutat. Res. 681, 13-23 (2009).
- Olive, P. L., Banath, J. P. Kinetics of H2AX phosphorylation after exposure to cisplatin. Cytometry B Clin. Cytom. 76, 79-90 (2009).
- Olive, P. L., Durand, R. E. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry A. 66, 1-8 (2005).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair. Molecular biotechnology. 26, 249-261 (2004).
- Fairbairn, D. W., Olive, P. L., O’Neill, K. L. The comet assay: a comprehensive review. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. 339, 37-59 (1995).
- Yang, E. S., Nowsheen, S., Wang, T., Thotala, D. K., Xia, F. Glycogen synthase kinase 3B inhibition enhances repair of DNA double-strand breaks in irradiated hippocampal neurons. Neuro-Oncology. 13, 459-470 (2011).
- Yang, E. S., et al. Lithium-mediated protection of hippocampal cells involves enhancement of DNA-PK dependent repair in mice. The Journal of clinical investigation. , 119-1124 (2009).
- Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study. Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).
- Smith, C. C., O’Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).
- Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).
- Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).
- Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4 (2010).
- Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines. Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).
- Bonner, W. M., et al. [gamma]H2AX and cancer. Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).
- Finney, M. Pulsed Field Gel Electrophoresis. Current protocols in molecular biology. , (2000).
- Electrophoresis, F. I., et al. . Pulsed-field gel electrophoresis. , (2000).
- Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy. Radiotherapy and Oncology. , (2011).
