개인의 GFP 태그 단백질 또는 autofluorescent 구조의 라이브 영상을위한 프로토콜<em> Drosophila</em> oocytes가 설명되어 있습니다.
Drosophila의 난 모세포는 같은 cytoskeletal 기능, 세포 조직 및 세포 기관의 구조와 기능 등의 근본적인 질문에 대해 조사를위한 다양한 시스템으로 설립되었습니다. 다양한 GFP 태그 단백질의 가용성은 여러 세포 프로세스가 몇 분, 아님 몇 시간의 과정을 통해 세포를 사는,이 기술을 사용하여 모니터링 할 수 있다는 것을 의미합니다, 이러한 RNP 교통, 상피 morphogenesis 및 조직 리모델링과 같은 프로세스는 훌륭한 자세히 설명되어 Drosophila의 oocytes의 1,2 인치
돌연변이의 풍부한 레퍼토리와 함께 비디오 이미징을 수행 할 수있는 능력은 유전자 및 프로세스의 거대한 다양한 종류의 놀라운 세부 사항에서 검토 할 수 있습니다. 하나의 예는 중간 oogenesis 3,4에서 시작 ooplasmic 스트리밍의 과정입니다. 세포질 소포의 활발한 움직임은 미세 소관과 kinesin 종속적 인 5 및 유용한 치세요을 제공합니다이 단계에서 세포 골격 기능을 조사하는 TEM.
난 여기 거의 모든 공 촛점 현미경 설정을 사용하여 생활 oocytes의 시간 경과 영상을위한 프로토콜을 제시한다.
Drosophila의 oocytes는 세포와 subcellular 구성 요소의 기능과 조직에 관한 질문의 다양한 해결을 위해 다양한 모델 시스템입니다. 단백질 기능의 전체 이해 단백질 행동 모두 공간과 시간적 측면의 모니터링이 필요합니다. Drosophilists 사용할 수 이미징 시스템과 유전 도구 모두에서 진보는 가능도 작은 실험실 생활 oocytes에서 고품질의 영상 실험을 수행 할 수 있도록. 난 여기 단백질 기능을 조사하기 위해 유전 배경을 다양한와 함께 사용할 수있는 늦은 oogenesis 중순에하는 동안 GFP-태그 또는 autofluorescent 단백질과 구조의 동작을 분석 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.
이 프로토콜에서 나는 oocytes는 이미징 및 형광 단백질과 구조의 시간 경과 영상 취득이 활성화됩니다 기본 공 촛점 설정을 위해 준비하는 과정을 설명합니다. 추가 detai난 모세포 준비에이게는 Weil 외 의해 설명되어 있습니다. 6 다양한 endogenously 엑손 – 트래핑를 통해 태그 된 단백질을 표현 플라이 변종 8 이용하실 수 있으며, 무한 더 많은 단백질 변형이 설계 및 파리에 다시 제출 할 수 있습니다.
생활 조직과 협력에서, 표본의 건강은 가장 중요한 중요합니다. 무대 10B에서 알 챔버는 단기 이미징 연구에 이상적입니다, 기본적으로 자율적 인 방식으로 11 oogenesis을 완료 할 수 있습니다. 케어는 고품질의 데이터를 얻을 수 몇 가지 주요 단계에서 촬영해야합니다. 해부하는 동안은 가능한 한 작은으로 난소와 oocytes를 조작하고, 해부 및 이미징의 완료 사이의 시간의 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 이상적으로, 작은 절개 역은 공 촛점 범위를 소장 같은 방에 있어야하고, 한 번에 몇 계란 챔버는 이미징해야합니다. 번호 (5-8 여기에 권장) 좋은 품질의 이미지를 얻을 가능성을 극대화 해부 시간이 최소화 될 수 있도록합니다. I 이미지 품질을 평가하고 캡처 설정이 더 이상 시간 경과 순서를 캡처하기 전에 최적화되어 있는지 확인 이미지의 짧은 시리즈를 캡처하는 것이 좋습니다. 대부분의 소프트웨어는 개별 프레임을 저장할 수 있으며, 이러한 이미지는 다음 ImageJ 12 다른 소프트웨어를 사용하여 다양한 방법으로 분석 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH 지역 프로그램에서 보조금 GM096076에 의해 지원되었다.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
#5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |