Анализ изображений нейрона к Glia Взаимодействие в Микрофлюидных Платформа культуры (MCP) на основе нейронных аксонов и глии Co-культуре системы
Summary
Данное исследование описывает процедуры создания новых нейронных аксонов и (ASTRO) глии совместного культивирования платформы. В этой совместной системе культуры, манипуляции прямого взаимодействия между одним аксона (и единственной глиальных клеток) становится возможным, позволяя механистического анализа взаимного нейрона к глиальных сигнализации.
Abstract
Правильное нейрона к глии взаимодействие имеет решающее значение для физиологических функций центральной нервной системы (ЦНС). Это двусторонняя связь изощренно опосредовано конкретных сигнальных путей между нейроном и глии 1,2. Идентификация и характеристика этих сигнальных путей имеет важное значение для понимания того, как нейрон глия взаимодействия физиологии ЦНС формы. Ранее нейронов и глии смешанных культур были широко использованы для тестирования и характеризующие сигнальные пути между нейроном и глии. То, что мы узнали из этих препаратов и других инструментов в естественных условиях, однако, предположил, что взаимное сигнализации между нейроном и глии часто происходило в конкретных отделений в нейронах (т.е., аксон, дендритов, или сома) 3. Это делает его важным для разработки новой системы культуры, которые позволяют разделение отсеков нейронов и, в частности исследует взаимодействие между глии и нейровнутренней аксоны / дендритов. Кроме того, обычные смешанной системе культуры не способны дифференцироваться растворимых факторов и прямой контакт мембраны сигналы между нейроном и глии. Кроме того, большое количество нейронов и глиальных клеток в обычных совместного культивирования системе отсутствует разрешение, необходимое для наблюдения за взаимодействием между одним аксонов и глиальных клеток.
В этой работе мы описываем новую аксонов и глии совместного культивирования системы с использованием платформы микрофлюидных культуре (MCP). В этой совместного культивирования системы, нейроны и глиальные клетки культивируют в двух отдельных камер, которые подключены через несколько центральных каналов. В этом микрофлюидных платформе культуры, только нейронных процессов (особенно аксоны) может войти в глиальных стороне через центральные каналы. В сочетании с мощной флуоресцентной маркировки белков, эта система позволяет непосредственного изучения сигнальных путей между аксональной / дендритные и глиальные взаимодействия, такие,с аксон-опосредованной регуляции транскрипции в глии, глия-опосредованной рецепторами нейронов торговли терминалы, и глии-опосредованного роста аксонов. Узкого диаметра камеры также значительно запрещает поток нейронов обогащенной среды в глиальных камеры, облегчая зондирования прямого мембранного белка взаимодействия между аксонами / дендритов и глиальных поверхности.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCP на основе нейронов и астроцитов совместного культивирования система позволяет рассечение подробную нейрона к астроглии сигнальных путей, позволяя только аксоны проходят центральные каналы и взаимодействия с астроглиальных клеток. Это сотрудничество культура система может быть л…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-р Джеффри Ротштейн для обеспечения BAC GLT1 УЗФБ мышей и GLT1 антитела; Тафтса Центр Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) за ценные объекты ядра; Новый факультет набора гранта (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Фил Хей) в Тафтса Neuroscience департамента.
Materials
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
|
Neuron culture medium for plating cell
|
|||
|
Astrocyte culture medium
|
|||
|
Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
