ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות
Summary
מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.
Abstract
נוירון הנכון לאינטראקצית גליה הוא קריטי לתפקוד פיסיולוגי של מערכת העצבים המרכזית (CNS). תקשורת דו כיוונית זו מתווכת על ידי מתוחכמת מסלולי איתות ספציפיים בין תא העצב ו1,2 גליה. זיהוי ואפיון של מסלולי האיתות הללו חיוניים להבנה של איך נוירון לפיזיולוגית CNS צורות אינטראקצית גליה. בעבר, תרבויות נוירון וגליה המעורבות כבר נוצל באופן נרחב לבדיקה ואפיון מסלולי איתות בין תא העצב וגליה. מה למד מהכנות ואחרות אלה בכלי vivo, לעומת זאת, הציע כי איתות הדדית בין תא עצב וגליה שאירעה לעתים קרובות בתאים ספציפיים בתוך הנוירונים (כלומר, אקסון, דנדריט, או סומא) 3. זה עושה את זה חשוב לפתח מערכת תרבות חדשה המאפשרת פרדה של תאים עצביים ובמיוחד בוחן את האינטראקציה בין גליה ונוירואקסונים / דנדריטים nal. בנוסף, מערכת התרבות המעורבת הקונבנציונלית אינה מסוגלת להבדיל את הגורמים המסיסים ואותות קשר ישירים בין קרום תא העצב וגליה. יתר על כן, הכמות הגדולה של תאי עצב ותאי גליה במערכת הקונבנציונלית שיתוף התרבות חסרת רזולוצית הצורך לקיים אינטראקציה בין האקסון אחת ותא גליה.
במחקר זה, אנו מתארים מערכת גליה שיתוף תרבות האקסון רומן ועם השימוש בפלטפורמת תרבות microfluidic (MCP). במערכת זו שיתוף התרבות, נוירונים ותאי גלייה מתורבתים בשני חדרים נפרדים המחוברים באמצעות ערוצים מרכזיים מרובים. במצע תרבות microfluidic זה, רק תהליכים עצביים (בעיקר אקסונים) יכולים להיכנס לצד גליה בערוצים המרכזיים. בשילוב עם תיוג חלבון פלואורסצנטי חזק, מערכת זו מאפשרת חקירה ישירה של מסלולי איתות בין אינטראקציות axonal / הדנדריטים וגליה, כגוןרגולציה של האקסון בתיווך בתעתיק גליה סחר, גליה בתיווך הקולטן במסופים עצביים, וצמיחת האקסון גליה בתיווך. הקוטר הצר של החדר גם אוסר באופן משמעותי את הזרימה הבינונית נוירון המועשר לתא גלייה, בהנחיית חיטוט אינטראקצית קרום החלבון הישיר בין האקסונים / דנדריטים ומשטחי גליה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האסטרוציטים מערכת שיתוף תרבות נוירון מבוסס MCP ומאפשר נתיחה של נוירון המפורט למסלולי astroglia איתות שהיא מאפשרת רק את האקסונים עוברים בערוצים המרכזיים ואינטראקציה עם תאי astroglial. מערכת זו שיתוף התרבות ניתן להגדיר בנוחות עם נוירון הקונבנציונלי ונהלי התרבות astrocyte. אנחנו גם …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר ג'פרי רוטשטיין למתן עכברי BAC GLT1 eGFP וGLT1 נוגדנים; טאפטס מרכז למדעי מוח מחקר (NIH P30 NS047243; PI, רוב ג'קסון) לאספקת מתקני גרעין יקרים; סגל גיוס מענק חדש (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, פיל היידון) בטאפטס Neuroscience מחלקה.
Materials
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
|
Neuron culture medium for plating cell
|
|||
|
Astrocyte culture medium
|
|||
|
Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
