<sub> 1</sub> F<sub> O</sub> ATPase Vesicle Vorbereitung und Technik für Darstellende Patch-Clamp-Recordings von submitochondrialen Vesikelmembranen
Summary
Eine Methode, um submitochondrialen Vesikel in F1FO ATP-Synthase-Komplexe aus Rattenhirn angereichert isolieren beschrieben. Diese Vesikel erlauben das Studium der Aktivität von F1FO ATPase-Komplex und dessen Modulation unter Verwendung der Technik der Patch-Clamp-Aufnahme.
Abstract
Mitochondrien sind in vielen wichtigen zellulären Funktionen wie Stoffwechsel, Überleben 1, Entwicklung und Calcium-Signalgebung 2 beteiligt. Zwei der wichtigsten mitochondrialen Funktionen sind auf die effiziente Produktion von ATP, die Energie Währung der Zelle, die durch oxidative Phosphorylierung und die Vermittlung von Signalen für den programmierten Zelltod 3 bezogen.
Das Enzym in erster Linie verantwortlich für die Produktion von ATP ist die F1FO-ATP-Synthase, auch als ATP-Synthase 4-5. In den letzten Jahren hat sich die Rolle der Mitochondrien in apoptotischen und nekrotischen Zelltod erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. In apoptotischen Zelltod, geben Bcl-2-Proteine wie Bax äußeren Mitochondrienmembran, Oligomerisierung und Permeabilisierung der äußeren Membran, die Freigabe pro-apoptotische Faktoren in das Cytosol 6. In der klassischen nekrotischen Zelltod, wie die durch Ischämie oder Exzitotoxizität in Neuronen eine größ produzierte, schlecht reguliert Erhöhung Matrix Calcium trägt zur Öffnung der inneren Membran Poren, die mitochondriale Permeabilität Übergang Pore oder mPTP. Diese depolarisiert die innere Membran und verursacht osmotischen Verschiebungen, einen Beitrag zur äußeren Membran Ruptur, die Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren und Stoffwechselstörungen. Viele Proteine einschließlich Bcl-xL 7 interagieren F1FO ATP-Synthase, stetig seine Funktion. Bcl-xL interagiert direkt mit der beta-Untereinheit der ATP-Synthase F1FO, und diese Interaktion vermindert ein Leck Leitwert innerhalb der F1FOATPasecomplex, die Erhöhung der Netto-Transport von H + durch F1FO während F1FO ATPase Aktivität 8 und wodurch mitochondrialen Effizienz. Um die Aktivität und Modulation der ATP-Synthase studieren isolierten wir aus Nagergehirn submitochondrialen Vesikel (SMVS) enthält F1FO ATPase. Die SMVS behalten die strukturelle und funktionelle Integrität des F1FO ATPase nach Alavian et al. Hier beschreiben wir eine Methodedass wir erfolgreich für die Isolierung von SMVS aus Rattenhirn verwendet und wir Abgrenzung der Patch-Clamp-Technik, um Kanal-Aktivität zu analysieren (ion Leck Leitwert) der SMVS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen die Gewinnung von reinem Mitochondrien am Ende von Schritt 1 und submitochondrialen Vesikel (SMVS) nach Schritt 2 aus ganzen Gehirn ohne Unterschied der Zelle durch dieses Verfahren phenotypes.SMVspurified im wesentlichen frei von Verunreinigung durch andere subzelluläre Organellen, wie in Abbildung 1 und unserer bisherigen Arbeit (Alavian KN et al. 8) und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität vor dem Einfrieren. Nach…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | |
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | |
| Digidata 1440A | Molecular Device | |
| pClamp10.0 | Molecular Device | |
| Manipulator | Sutter Instrument | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
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