<sub> 1</sub> F<sub> O</sub> ATPase Vesicle Préparation et Technique for the Performing Patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales
Summary
Une méthode pour isoler les vésicules submitochondriales enrichis en F1FO ATP synthase complexes du cerveau de rat est décrite. Ces vésicules permettent l'étude de l'activité de F1FO complexe ATPase et sa modulation en utilisant la technique de l'enregistrement de patch-clamp.
Abstract
Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires importantes, y compris le métabolisme, la survie à 1, le développement et la signalisation calcium 2. Deux des fonctions mitochondriales les plus importants sont liés à la production efficace de l'ATP, la devise de l'énergie de la cellule, par phosphorylation oxydative et la médiation des signaux de mort cellulaire programmée 3.
L'enzyme principalement responsable de la production de l'ATP synthase est le F1FO-ATP, aussi appelé ATP synthase 4-5. Au cours des dernières années, le rôle des mitochondries dans la mort cellulaire par apoptose et nécrose a reçu une attention considérable. Dans la mort cellulaire par apoptose, BCL-2 protéines de la famille tels que Bax entrent dans la membrane mitochondriale externe, s'oligomériser et perméabilisent la membrane externe, libérant des facteurs pro-apoptotiques dans le cytosol 6. Dans la mort cellulaire nécrotique classique, telle que celle produite par une ischémie ou excitotoxicité des neurones, un large, augmentation mal régulé en calcium de la matrice contribue à l'ouverture d'un pore de la membrane intérieure, le pore de transition de perméabilité mitochondriale ou mPTP. Cette dépolarise la membrane interne et provoque des changements osmotiques, en contribuant à la rupture de la membrane externe, libération de facteurs pro-apoptotiques, et un dysfonctionnement métabolique. De nombreuses protéines dont la protéine Bcl-xL 7 interagir avec F1FO ATP synthase, de moduler sa fonction. Bcl-xL interagit directement avec la sous-unité bêta de l'ATP-synthase F1FO, et cette interaction diminue une conductance de fuite à l'intérieur de la F1FOATPasecomplex, augmentant le transport net de H + par F1FO pendant F1FO activité ATPase 8 et augmentant ainsi l'efficacité mitochondriale. Pour étudier l'activité et de la modulation de l'ATP synthase, nous avons isolé à partir de rongeurs cerveau submitochondriales vésicules (SMVS) contenant F1FO ATPase. Les SMVS conserver l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la F1FO ATPase comme indiqué dans Alavian et al. Ici, nous décrivons une méthodeque nous avons utilisé avec succès pour l'isolement du SMVS de cerveau de rat et nous délimiter la technique de patch-clamp pour analyser l'activité du canal (ion fuite conductance) de la SMVS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les procédés décrits ici permettent l'isolement des mitochondries pur à la fin de l'étape 1 et des vésicules submitochondriales (SMVS) après l'étape 2 de cerveau entier, sans distinction de cellules phenotypes.SMVspurified par ce procédé sont essentiellement exempt de contamination par d'autres organelles sous-cellulaires comme indiqué dans Figure 1 et notre travail précédent (Alavian KN et al. 8) et conserver leur intégrité structurale et fonctionnelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | Company | Catalogue number |
| Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 |
| Eppendorf Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 |
| 4639 Cell Disruption Vessel | Parr Instrument Company | 4639 |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 |
| Polycarbonate centrifuge tubes | Beckman Coulter | P20314 |
| SW-50.1 rotor | Beckman Coulter | |
| L8-70M Ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D5628 |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | |
| Digidata 1440A | Molecular Device | |
| pClamp10.0 | Molecular Device | |
| Manipulator | Sutter Instrument | |
| Borosilicate glass capillary | World Precision Instruments | 1308325 |
| Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87 | Sutter Instrument |
References
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