Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

1. AAPC Üretimi Boncuk proteinler eklemeden önce tüm reaktifler ve tamponlar hazırlamak: 0.1M Borat tampon; 1X D-PBS (hiçbir Ca 2 + ve Mg 2 +); Boncuk Yıkama Tamponu (1X PBS +5% İnsan AB serumu +% 0.02 sodyum azid) , tam bir ortam (RPMI medyumu ile +100 mM sodyum piruvat, 10 mM gerekli olmayan vitamin çözeltisi, 100 mM MEM vitamini çözeltisi,% 1 2-merkaptoetanol, 10 uM siprofloksasin,% 5 insan AB serumu); MACS tampon (1 L serbest PBS Ca 2 + ve Mg + 2, 5 g BSA, 2 mmol EDTA). 5 ml'lik şeffaf borosilikat cam şişe içinde dişli steril 3 ml 0.1 M borat tamponu (borik asit ve su, pH 7.0-7.4) ile 1 ml Dynabeads M-450 epoksi boncuklar yıkayın. 1 ml PBS w / o Ca 2 + ve Mg + 2: ayrı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 100 mg hCD1d-Ig dimer ve 20 ug birlikte uyaran moleküller (örneğin anti-CD28mAb) ekleyin. <li> Sıra boncuk gelen mıknatıs ve aspirat borat tamponu üzerine cam flakon içeren. Adım 1.2 cam şişeye protein karışımı ekleyin ve kapağını kapatın. Ters flakon hemen karıştırın, bir rotator üzerinde parafilm ile kapak ve yeri kapsayacak ve 4 ° C'de bir gece inkübe Dikkatle boncuk kaçınarak Ertesi gün, bir yerde cam mıknatıs üzerine flakon ve protein karışımı çıkarın. 3 ml boncuk yıkama tampon maddesi (PBS,% 5 AB serumu +0.02% sodyum azid) eklenmesi, ve 5 dakika için bir döndürücü üzerine, 4 ° C sıcaklıkta inkübe ederek boncuk yıkayın. Iki kez tekrarlayın. Boncuklar bu boncuk yıkama karışım içinde saklanabilir. Fonksiyonel AAPC yapmak için, küçük bir kısım çıkarın ve bir hemasitometre boncuk saymak. Proteinler stably antikorlar (örn. PE-konjuge anti-fare IgG1) ile boyanarak ve flow sitometri analizleri yaparak boncuk üzerine yüklendiğini kontrol edin. Antijen ile boncuk yüklemek için, 5 x 10 7 boncuk kaldırmak, ve küçük bir 1.5 ml bir cam şişeye ekleyin, 1 ml steril PBS ile boncuk yıkayın. Resuspend 1 ml steril PBS ile boncuk yıkandı ve antijen ekleyin; örneğin: α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml) ile yükleyin. * Not: biz lipid çözünürlüğün ya misel oluşumu ile herhangi bir sorunları tespit etmemiş olsak bile, lipidler üretici tavsiyelerine göre ele alınmalıdır. Özellikle, KRN7000 bu çalışmalar için DMSO (1mg/ml) içinde yeniden oluşturuldu. KRN7000 glikolipid ve başka antijenler de 0.2 mg / ml PBS içeren% 0.5 içinde çözülebilir Tween-20 (2 saat sonikasyon. 37 ° C'de). ÖNEMLİ-AAPC kullanımdan önce en az 48-72 saat boyunca yüklü olması gerekir. 2. CD161 + CD3 + Hücre İzolasyonu Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) toplayın. Bir buffy coat veya lökoferez paketi lenfositlerin Ficoll yoğunluk gradyan santrifüj ayırma için, ilk olarak oda sıcaklığında 1X PBS eşit bir hacmi ile heparinize kan seyreltin. 15 ml Ficoll (oda sıcaklığına ısıtıldı) 50 ml konik tüpe ekleyin. Yavaşça bindirme25 Ficoll üstüne seyreltilmiş kan karışımı ml. Freni ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 2000 rpm'de santrifüj yapılır. Dikkatlice Pasteur pipeti ile lenfosit arabirimi (medya ve Ficoll arasındaki beyaz halka) kaldırmak ve yeni bir 50 ml konik tüp aktarabilirsiniz. PBS ile 50 ml'ye tüp doldurma ve 5 dakika boyunca 1500 rpm'de santrifüj yoluyla hücreler yıkanır. Süpernatantı atın ve tek bir tüp, tek bir bireyden tüpler birleştirmek ve 20 ml PBS ile tekrar periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) yıkayın. Daha sonra PBMC saymak ve 5 x 10 7 hücre / MACS tampon içinde ml 'lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon (Ca 2 1 L serbest PBS + ve Mg + 2, 5 g BSA, 2 mmol EDTA). T hücre fraksiyonunun izole edilmesi için, PBMC (10 8 hücreleri) 2 ml ile başlar ve EasySep insan T hücresi Zenginleştirme Kit Pan T hücre zenginleştirme çözeltisinden 100 ul ilave edin. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li> Başka bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında ve çözelti inkübe manyetik parçacıkların 100 ul ekle. 2.5 ila çözücü ml nihai hacim getirin ve 5 dk için mor mıknatıs olarak yerleştirilir. Hızlı bir 15 ml konik tüp içine CD3 + fraksiyonu kapalı dökün. 5 ml soğuk tampon MACS eklenmesi ile yıkayın hücrelerini, yaşayabilir hücrelerin sayısını saymak ve FACS boyanması için bir tablet çıkarmak. 980 ul buz soğuk MACS tampon CD161 + hücreler, ilk tekrar süspansiyon zenginleştirilmiş T hücreleri seçmek için, 10 mikrogram anti-CD161 mAb ekleyin ve 10 dakika buzdolabında beklettikten sonra kullanın. 5 dk için 4 ° C sıcaklıkta 1500 rpm'de hücreler santrifüj yapılır. MACS tamponu 800 ul Sonra sulandırmak hücre pelletini. Anti-fare IgG1 mikroboncuk 200 ul ekle ve 4. 10 dakika için çözelti inkübe ° C İnkübasyon bu adım sırasında, 3 ml MACS tampon eklenerek bir LS kolon dengelenmeye. Daha sonra, 5 dakika boyunca 4 ° C'de 1,500 rpm'de santrifüj ile hücreler yıkanır. Resu3 ml MACS tampon içinde hücreler geçirirler. Sonra, LS MACS ayıran sütun içine pipetle hücreler. Yavaş pipetleme kabarcıklar üreten önlemek için emin olun. MACS tampon, 3 ml ilave edilerek sütun yıkayın. Iki kez tekrarlayın. 3 ml taze MACS tamponu ekleyin ve mıknatıstan sütun kaldırmak. 15 ml konik tüp içine yerleştirin sütun. Piston takın ve saflaştırılmış CD161 + CD3 + hücreler elde etmek içeriğini dışarı itin. Kont NKT hücre fraksiyonu zenginleştirilmiştir. Sen 2-4 milyon hücre olmalıdır. 3. AAPC aracılı NKT Hücre Genişletme 16 ml tam bir ortam (tam bir ortam + IL-2, 100 U / ml) içinde 10 6 zenginleştirilmiş CD161 + CD3 + T hücreleri ve 10 6 AAPC eklenmesi ile ko-kültür ayarlayın. , 96 iyi doku kültürü tedavi polistiren için düşük buharlaşma kapaklı U-alt plaka 160 sıra nihai / ul hacim ekleyerek Plate bu karışımı. Taze orta 80 ul ekleyerek her 7 inci günü orta değişimi gerçekleştirin. Hasathücreler, saymak ve günde 12-14 FACS boyaması gerçekleştirin. Genişletilmiş NKT hücreleri, özellikle 16 ml tam bir ortam içinde 10 6 genişletilmiş T-hücreleri ve 10 6 AAPC tekrar süspansiyon, yukarıda adım 3.1 'de tarif edildiği gibi replated edilebilir. Ul / kuyu bir 96 U-alt plaka 160 ekleyerek Levha bu karışım. Taze orta 80 ul ekleyerek her 7 inci günü kokültürü orta yenilemek için devam edin. Bu genişleme ikinci turu sonrasında ekstra NKT hücreleri dondurmak için en iyi (1 ml% 5 DMSO / 95% FBS 1 x10 6 / cryovial.) 4. İşlevsel Test: NKT Hücre AAPC aracılı Uyarım 5×10 4 NKT hücreleri kurma / de 96 U-alt plaka 200 ul son hacim (tam orta) olarak 5×10 5 AAPC ile. 24-48 saat sonra ELISA Hasat hücre kültür süpernatant.