Künstliche Antigen-präsentierenden Zelle (AAPC) vermittelte Aktivierung und Expansion der Natural Killer-T-Zellen

Ein. Generation von AAPC Bevor die Zugabe von Proteinen Perlen, bereiten alle Reagenzien und Puffer: 0,1 M Boratpuffer, 1x D-PBS (ohne Ca 2 + und Mg 2 +); Bead Waschpuffer (1X PBS +5% humanem AB-Serum + 0,02% Natriumazid) ; Komplettes Medium (RPMI Medium, 100 mM Natriumpyruvat, 10 mM nicht-essentielle Vitaminlösung, 100 mM MEM Vitamin-Lösung, 1% 2-Mercaptoethanol, 10 uM Ciprofloxacin, 5% humanem AB-Serum); MACS-Puffer (1 l PBS freien der Ca 2 + und Mg 2 +, 5 g BSA und 2 mmol EDTA). Spülen 1 ml Dynabeads M-450 Epoxy Perlen mit 3 ml sterilem 0,1 M Boratpuffer (Borsäure und Wasser, pH 7,0 bis 7,4) in einem 5 ml Borosilikatglas Gewinde Fläschchen. In einem separaten 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 100 ug hCD1d-Ig Dimer und 20 ug kostimulatorische Moleküle (Beispiel: Anti-CD28mAb) auf 1 ml PBS w / o Ca 2 + oder Mg 2 +. <li> Place bead mit Glasfläschchen auf Magnet und saugen Boratpuffer aus Perlen. Fügen Protein Mischung aus Schritt 1,2 bis Glasfläschchen und wieder aufsetzen. Sofort durch Umdrehen des Fläschchens, decken Sie die Kappe mit Parafilm, und auf einem Rotator und über Nacht bei 4 ° C. Am nächsten Tag, Ort Glasfläschchen auf Magnet und entfernen Proteinmischung, während sorgfältig vermieden Perlen. Waschen der Kügelchen durch Zugabe von 3 ml Wulst Waschpuffer (PBS mit 5% AB-Serum 0,02% Natriumazid), und Inkubieren bei 4 ° C auf einem Rotator für 5 min. Zweimal wiederholen. Kügelchen können in diesem Wulst wash Gemisch gelagert werden. Um funktionale AAPC machen, entfernen Sie ein kleines Aliquot und zählen Sie die Perlen mit einem Hämazytometer. Überprüfen, dass die Proteine ​​stabil sind auf die Kügelchen durch Färbung mit Antikörpern (zB PE-konjugierten Anti-Maus-IgG1) und Durchführen durchflusszytometrische Analyse geladen. Um Perlen mit Antigen zu laden, entfernen Sie 5 x 10 7 Perlen, und fügen Sie zu einem kleinen 1,5 ml Glasflasche, spülen Perlen mit 1 ml steriler PBS. Resuspend gewaschen Perlen mit 1 ml steriler PBS und fügen Antigen; Beispiel: Belastung mit α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Hinweis: Während wir keine Probleme mit Lipidlöslichkeit oder Micellenbildung haben erkannt, Lipide sollten nach den Empfehlungen des Herstellers behandelt werden. Insbesondere wurde KRN7000 in DMSO (1mg/ml) für diese Studien rekonstituiert. KRN7000 und anderen Glycolipid Antigene können auch in 0,2 mg / ml PBS, enthaltend 0,5% gelöst werden Tween-20 (2 Std. beschallen. Bei 37 ° C). Die WICHTIGER-AAPC müssen für mindestens 48-72 h vor der Verwendung geladen werden. 2. Isolierung von CD161 + CD3 +-Zellen Collect peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC). Für Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation Trennung von Lymphozyten aus einer Leukozytenmanschette oder Leukopherese Packung zunächst verdünnte heparinisiertem Blut mit einem gleichen Volumen von 1X PBS bei Raumtemperatur. 15 ml Ficoll (auf Raumtemperatur erwärmt) auf 50 ml konischen Röhrchen. Langsam Overlay25 ml des verdünnten Blut-Gemisch auf der Oberseite des Ficoll. Zentrifugieren bei 2000 rpm für 30 min bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet. Entfernen Sie vorsichtig die Lymphozyten-Schnittstelle (weißer Ring zwischen den Medien und Ficoll) mit einer Pasteurpipette und übertragen auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Waschen der Zellen durch Auffüllen des Rohres auf 50 ml mit PBS und Zentrifugieren bei 1500 UpM für 5 min. Verwerfen des Überstandes und verbinden die Rohre aus einem einzigen Individuum zu einem einzigen Rohr und waschen die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) erneut mit 20 ml PBS. Dann zählen die PBMC und resuspendieren in einer Konzentration von 5 x 10 7 Zellen / ml in MACS-Puffer (1 l PBS frei von Ca 2 + und Mg 2 +, 5 g BSA und 2 mmol EDTA). Um die T-Zell-Fraktion zu isolieren, mit 2 ml PBMC (10 8 Zellen) beginnen und mit 100 ul der Pan-T-Zell Bereicherung Lösung aus dem EasySep humanen T-Zell Enrichment Kit. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min. </li> Je 100 ul magnetischen Partikel zu der Lösung hinzugefügt und bei Raumtemperatur für weitere 10 min. Bringt das Endvolumen von 2,5 ml Lösungsmittel zu und das Reagenzglas in der purpurroten Magnet für 5 min. Schnell abgießen CD3 + Fraktion in einem 15 ml konischen Röhrchen. Waschen der Zellen durch Zugabe von 5 ml kaltem MACS-Puffer, zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen und Entfernen eines Aliquots für FACS-Färbung. Um die CD161 + Zellen, erste resuspendieren angereicherte T-Zellen in 980 ul eiskaltem MACS-Puffer auswählen, hinzufügen 10 ug anti CD161 mAb und inkubieren im Kühlschrank für 10 min. Zentrifugation der Zellen bei 1500 rpm bei 4 ° C für 5 min. Dann rekonstruieren das Zellpellet in 800 ul MACS-Puffer. Fügen Sie 200 ul Anti-Maus-IgG1 Mikroperlen und inkubieren die Lösung für 10 min bei 4 ° C. Während dieser Inkubationsschritt äquilibrieren eine LS Säule durch Zugabe von 3 ml MACS-Puffer. Weiter, wäscht die Zellen durch Zentrifugieren 1500 rpm bei 4 ° C für 5 min. Resuverbringen die Zellen in 3 ml MACS-Puffer. Dann pipettieren der Zellen in den LS MACS Trennkolonne. Achten Sie darauf, zu vermeiden Erzeugung von Blasen durch Pipettieren langsam. Spülen der Säule durch Zugabe von 3 ml von MACS-Puffer. Zweimal wiederholen. 3 ml frisches MACS-Puffer und entfernen Spalte von Magneten. Ort Spalte in eine 15 ml konischen Röhrchen. Legen Kolben und schieben Sie Inhalte gereinigte CD161 + CD3 + Zellen zu erhalten. Graf NKT-Zelle angereicherten Fraktion. Sie sollten haben 2-4 Millionen Zellen. 3. AAPC-vermittelte NKT Zellexpansion Einrichten Kokultur durch Zugabe von 10 6 angereicherten CD161 + CD3 + T-Zellen und 10 6 AAPC in 16 ml Vollmedium (Vollmedium + IL-2, 100 U / ml). Platte dieses Gemisch durch Zugabe von 160 ul / Vertiefung Endvolumen auf einer 96-Well-Gewebekultur-behandelten Polystyrol, U-Bodenplatte mit niedrigem Verdampfen Deckel. Führen Austausch des Mediums jeden 7. Tag durch Zugabe von 80 ml ​​frisches Medium. ErnteZellen zu zählen, und führen FACS-Färbung am Tag 12-14. Die expandierten NKT-Zellen können wie oben beschrieben ausplattiert in Schritt 3.1 werden, und zwar zu resuspendieren 10 6 expandierten T-Zellen und 10 6 AAPC in 16 ml Vollmedium. Platte dieses Gemisch durch Zugabe von 160 ul / Vertiefung einer 96-Well-U-Bodenplatte. Weiter zu Kokultur Medium aktualisieren jeden 7. Tag durch Zugabe von 80 ml ​​frisches Medium. Am besten ist es, zusätzliche NKT-Zellen nach der zweiten Runde der Expansion einzufrieren (1 x10 6 / Kryoröhrchen in 1 ml-5% DMSO / 95% FBS.) 4. Functional Test: AAPC-vermittelte Stimulation der NKT-Zellen Einrichten 5×10 4 NKT Zellen / Well mit 5×10 5 AAPC in 200 ul Endvolumen (komplettes Medium) in 96-Well-U-Bodenplatte. Ernte Zellkulturüberstand für ELISA nach 24-48 Stunden.