Kunstmatige antigeen presenterende cel (AAPC) gemedieerde activering en uitbreiding van Natural Killer T-cellen

1. Generatie AAPC Voor het toevoegen eiwitten aan beads, bereiden alle reagentia en buffers: 0,1 M boraatbuffer, 1X D-PBS (zonder Ca2 + en Mg2 +); Bead Wash Buffer (1X PBS +5% menselijk AB serum + 0,02% natriumazide) ; compleet medium (RPMI medium +100 mM natriumpyruvaat, 10 mM niet-essentiële vitamines, 100 mM MEM vitamine oplossing, 1% 2-mercaptoethanol, 10 uM ciprofloxacine, 5% menselijk AB serum) MACS buffer (1 L PBS free van Ca2 + en Mg2 +, 5 g BSA, en 2 mmol EDTA). Spoel 1 ml Dynabeads M-450 Epoxy kralen met 3 ml steriele 0,1 M boraatbuffer (boorzuur en water, pH 7.0-7.4) in een 5 ml helder borosilicaatglas schroefdraad flacon. In een afzonderlijke 1,5 ml microcentrifugebuisje, voeg 100 ug hCD1d-Ig dimeer en 20 ug costimulatoire moleculen (bijvoorbeeld anti-CD28mAb) naar 1 ml PBS w / o Ca2 + of Mg2 +. <li> Plaats kraal met daarin glazen flesje op de magneet en zuig boraatbuffer van kralen. Voeg eiwit mengsel van stap 1,2 tot glazen flacon en vervang dop. Meng onmiddellijk door het buisje, bedek de dop met parafilm, en op een rotator en incubeer overnacht bij 4 ° C. De volgende dag, plaats glazen flesje op de magneet en verwijder eiwitmengsel, terwijl zorgvuldig vermijden van kralen. Was de kralen door 3 ml bead wasbuffer (PBS met 5% AB serum +0.02% natriumazide) en incubatie bij 4 ° C op een rotator gedurende 5 minuten. Tweemaal herhalen. Kralen kunnen worden opgeslagen in deze kraal wash mengsel. Om functionele AAPC te maken, verwijdert u een kleine hoeveelheid en tel de kralen met behulp van een hemacytometer. Controleer of de eiwitten stabiel worden geplaatst op de parels door kleuring met antilichamen (ex. PE-geconjugeerd anti-muis IgG1) en het uitvoeren van flowcytometrische analyse. Om kralen te laden met antigeen, verwijdert u 5 x 10 7 kralen, en toe te voegen aan een kleine 1,5 ml glazen injectieflacon, spoel kralen met 1 ml steriele PBS. Resuspend gewassen kralen met 1 ml steriele PBS en voeg antigeen; voorbeeld: Load met α-GalCer/KRN7000 (5mg/ml). * Opmerking: Tijdens het, we hebben niet gedetecteerd eventuele problemen met vetoplosbaarheid of micelvorming, lipiden dient te worden behandeld volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Specifiek werd KRN7000 gereconstitueerd in DMSO (1mg/ml) voor deze studies. KRN7000 en glycolipide antigenen kunnen ook worden opgelost in 0,2 mg / ml PBS die 0,5% Tween-20 (ultrasone trillingen 2 uur. Bij 37 ° C). BELANGRIJK-De AAPC moeten worden geladen ten minste 48-72 uur voor gebruik. 2. Isolatie van CD161 + CD3 + cellen Verzamel perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC). Voor Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie scheiding van lymfocyten uit een buffy coat of leukoferese pack, eerst verdunnen gehepariniseerd bloed met een gelijk volume van 1X PBS bij kamertemperatuur. Voeg 15 ml Ficoll (opgewarmd tot kamertemperatuur) tot 50 ml conische buizen. Langzaam overlay25 ml van het verdunde bloed mengsel op de Ficoll. Centrifugeer bij 2000 rpm gedurende 30 min bij kamertemperatuur met de rem uit. Verwijder voorzichtig de lymfocyt-interface (witte ring tussen de media en Ficoll) met een Pasteur pipet en over te dragen aan een nieuwe 50 ml conische buis. Spoel de cellen door het opvullen van de buis 50 ml met PBS en centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en combineren de buizen van een persoon aan een buis en nawassen het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) met 20 ml PBS. Vervolgens telt de PBMC en resuspendeer in een concentratie van 5 x 10 7 cellen / ml in MACS buffer (1 L PBS zonder Ca2 + en Mg2 +, 5 g BSA, en 2 mmol EDTA). Om de T-cel fractie te isoleren, te beginnen met 2 ml van PBMC (10 8 cellen) en voeg 100 ul Pan T cel verrijkingscocktail oplossing uit de EasySep Human T Cell Enrichment Kit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li> Voeg 100 ul van magnetische deeltjes aan de oplossing en incubeer bij kamertemperatuur gedurende nog 10 minuten. Breng het uiteindelijke volume van het oplosmiddel tot 2,5 ml en plaatst de buis in de paarse magneet gedurende 5 minuten. Snel giet het CD3 + fractie in een 15 ml conische buis. Spoel de cellen door toevoeging van 5 ml koud MACS buffer, telt het aantal levensvatbare cellen en verwijderen van een aliquot van FACS kleuring. De CD161 + cellen, eerste hersuspenderen verrijkte T cellen te selecteren in 980 ul ijskoude MACS buffer, voeg 10 ug anti CD161 mAb, en incubeer in de koelkast gedurende 10 minuten. Centrifugeer de cellen bij 1500 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Vervolgens reconstrueren de celpellet in 800 ui MACS buffer. Voeg 200 ul van anti-muis IgG1 microbeads en incubeer de oplossing gedurende 10 min bij 4 ° C. Tijdens deze incubatiestap equilibreer een LS kolom door 3 ml MACS buffer. Vervolgens was de cellen door centrifugeren 1500 rpm bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Automabrengen de cellen in 3 ml MACS buffer. Pipetteer dan de cellen in de LS MACS scheidingskolom. Zorg ervoor dat u het genereren van luchtbellen te vermijden door pipetteren langzaam. Spoel de kolom door 3 ml MACS buffer. Tweemaal herhalen. Voeg 3 ml verse MACS buffer en verwijder kolom van magneet. Plaats de kolom in een 15 ml conische buis. Plaats zuiger en duwen inhoud aan gezuiverd CD161 + CD3 + cellen te verkrijgen. Graaf NKT cel verrijkt fractie. Je moet over 2-4 miljoen cellen. 3. AAPC-gemedieerde NKT celexpansie In co-cultuur door 10 6 verrijkte CD161 + CD3 + T-cellen en 10 6 AAPC in 16 ml compleet medium (compleet medium + IL-2, 100 U / ml). Plate dit mengsel door het toevoegen van 160 ul / putje eindvolume van een 96 well weefselkweek behandeld polystyreen, U-bodemplaat met lage verdamping deksel. Voer medium uitwisseling elke 7 de dag door het toevoegen van 80 pl vers medium. Oogstcellen, tellen, en het uitvoeren van FACS-kleuring op dag 12-14. De geëxpandeerde NKT cellen worden opnieuw uitgeplaat zoals hierboven beschreven in stap 3.1, specifiek 10 6 geëxpandeerde T-cellen en 10 6 AAPC resuspenderen in 16 ml compleet medium. Plaat dit mengsel door toevoeging van 160 ul / putje van een 96 putjes U-bodemplaat. Blijven co-cultuur medium vernieuwen elke 7 de dag door het toevoegen van 80 pl vers medium. Het beste is om extra NKT cellen in te vriezen na de tweede ronde van expansie (1 x10 6 / Cryovial in 1 ml-5% DMSO / 95% FBS.) 4. Functionele Test: AAPC-gemedieerde stimulatie van NKT-cellen Stel 5×10 4 NKT cellen / putje met 5×10 5 AAPC in 200 ul eindvolume (compleet medium) in 96 en U-bodemplaat. Harvest celkweeksupernatant voor ELISA na 24-48 uur.