في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض
Summary
ووصف الإجراء لمعالجة النشاط الدماغي من الخلايا العصبية الهرمية القشرية optogenetically بينما رصد الكهربائي، مخطط كهربية العضل، وتركيز اللاكتات الدماغي. يتم تنفيذ تسجيلات تجريبية على الفئران، في حين أنها المربوطة الكابل الخضوع عفوية النوم / اعقاب دورات. يتم تجميع معدات Optogenetic في مختبرنا، ومعدات التسجيل متاح تجاريا.
Abstract
على الرغم من أن الدماغ يمثل أقل من 5٪ من الجسم عن طريق الإعلام، فإنه يستخدم ما يقرب من ربع الجلوكوز التي يستخدمها الجسم أثناء الراحة 1. وظيفة العين السريعة من النوم غير حركة (NREMS)، الجزء الأكبر من النوم قبل الوقت، غير مؤكد. ومع ذلك، واحدة من أبرز سمات NREMS هو انخفاض كبير في معدل استخدام الجلوكوز الدماغي نسبة إلى اليقظة 2-4. وقد أدت هذه النتائج وغيرها إلى الاعتقاد السائد أن النوم يؤدي وظيفة ذات الصلة الأيض الدماغي. ومع ذلك، فإن آليات التي تقوم عليها تخفيض في ايض الجلوكوز الدماغي خلال NREMS لا يزال يتعين توضيح.
واحد الظاهرة المرتبطة NREMS التي قد تؤثر الدماغي معدل الأيض هو حدوث موجات بطيئة، التذبذبات على ترددات أقل من 4 هرتز، في الكهربائي 5،6. هذه الموجات البطيئة الكشف على مستوى الجمجمة أو القشرية الدماغية سطح تعكسالتذبذبات الكامنة بين الخلايا العصبية دولة استقطابها / يصل ودولة hyperpolarized / بنسبة 7. أثناء حالة أسفل، الخلايا لا تخضع إمكانات العمل لفترات تصل إلى عدة مئات من ميلي ثانية. استعادة التدرجات الأيونية بعد تركيز إمكانات العمل يمثل عبئا كبيرا على التمثيل الغذائي للخلية 8؛ غياب إمكانات العمل أثناء حالات أسفل المرتبطة NREMS يمكن أن تسهم في خفض التمثيل الغذائي النسبي لايقاظ.
كان اثنين من التحديات التقنية التي ينبغي معالجتها من أجل هذه العلاقة افتراضية لفحصها. أولا، كان من الضروري لقياس الأيض الدماغي حال السكر مع قرار الزمنية يعكس ديناميات EEG الدماغي (أي، أكثر من ثانية بدلا من دقيقة). للقيام بذلك، قمنا بقياس تركيز اللاكتات، نتاج تحلل الهوائية، وبالتالي قراءات من معدل ايض الجلوكوز في مخ الفئران. كان اللاكتاتتقاس باستخدام أوكسيديز القائمة على استشعار اللاكتات الوقت الحقيقي جزءا لا يتجزأ من القشرة الأمامية. آلية الاستشعار عن بعد يتكون من القطب البلاتين إيريديوم محاطة بطبقة من جزيئات أوكسيديز اللاكتات. استقلاب اللاكتات بواسطة أوكسيديز اللاكتات تنتج بيروكسيد الهيدروجين، التي تنتج تيارا في القطب البلاتين إيريديوم. لذلك تكثف من تحلل الدماغ يوفر زيادة في تركيز الركيزة لاكتات أوكسيديز، الذي ثم ينعكس في زيادة الحالية في القطب الاستشعار عن بعد. بالإضافة إلى ذلك كان من الضروري لقياس هذه المتغيرات في حين التلاعب في استثارة القشرة الدماغية، وذلك لعزل هذا المتغير من جوانب أخرى من NREMS.
ضعنا نظام تجريبي لقياس نشاط الخلايا العصبية في وقت واحد عن طريق elecetroencephalogram، وقياس تدفق حال السكر عن طريق المجس البيولوجي اللاكتات، والتلاعب في الخلايا العصبية الدماغية القشرية النشاط عن طريق تفعيل optogenetic من PYRAميدال الخلايا العصبية. وقد استخدمت هذا النظام ونحن لتوثيق العلاقة بين الطول الموجي الكهربي النوم ذات الصلة وديناميات لحظة إلى لحظة تركيز اللاكتات في القشرة الدماغية. البروتوكول قد تكون مفيدة للكل ذي مصلحة في دراسة والتصرف بحرية في القوارض، والعلاقة بين قياس نشاط الخلايا العصبية على مستوى تخطيط كهربية و طاقة الخلوية داخل الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
عرض طرق تسمح لأحد هنا لقياس العلاقة بين النوم والتغيرات في تركيز الدماغ من اللاكتات وسيطة حال السكر على نطاق والوقت ليس من الممكن في السابق. الحيوانات الخضوع التحولات التلقائية بين NREMS، وبعد REMS. وعلاوة على ذلك، نحن قادرون على تطبيق محفزات optogenetic بينما الحيوانات الخضو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الأبحاث الممولة من قبل وزارة الدفاع (الدفاع كالة مشاريع البحوث المتقدمة، جائزة الشباب كلية، منحة رقم N66001-09-1-2117) وNINDS (R15NS070734).
Materials
| Component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BASi Mouse Guide Cannula | Pinnacle Technology/BASi Inc | 7032 | |
| Lactate Biosensor | Pinnacle Technology | 7004 | |
| Head Mount | Pinnacle Technology | 8402 | |
| Sleep/Biosensor Recording system | Pinnacle Technology | 8400-K1-SL | 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor |
| Tethered Mouse in-vitro Calibration kit | Pinnacle Technology | 7000-K1-T | |
| Fiber Optic Guide Cannula | Plastics One | C312G | 21 Gauge Guide Cannula |
| Dummy Cannula | Plastics One | C312DC | 21 Gauge Dummy |
| Diamond Fiber Scribe | Thorlabs | S90W | |
| Fiber Connector Crimp Tool | Thorlabs | CT042 | |
| Furcation Tubing | Thorlabs | FT030 | 03.0 mm |
| Thorlabs | T10S13 | Max Dia. 0.012 | |
| Furcation Tube Stripper | Thorlabs | FTS3 | |
| Bare Hard Cladding Multimode Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm Core, 0.37 NA |
| Wire Snips/Kevlar Shears | Thorlabs | T865 | |
| Fiber Optic Epoxy | Thorlabs | F112 | |
| Fiber Stripper Tool | Thorlabs | ||
| Glass Polishing Plate | Thorlabs | CTG913 | |
| Rubber Polishing Pad | Thorlabs | NRS913 | |
| Eye Loupe | Thorlabs | JEL10 | |
| Kim Wipes | Thorlabs | KW32 | |
| Compressed Air | Thorlabs | CA3 | |
| Polishing Puck | Thorlabs | D50-xx | |
| Fiber Inspection scope | Thorlabs | CL-200 | |
| Polishing Films | Thorlabs | LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P | |
| FC/PC connector end | Thorlabs | 30126G2-240 | 240 μm Bore, SS Ferrule |
| MC Stimulus Unit | Multi-Channel Systems | STG-4002 | |
| MC Stimulus Software | Multi-Channel Systems | MC-Stimulus V 2.1.5 | |
| Blue Laser | CrystaLaser | CL473-050-0 | |
| Laser Power supply | CrystaLaser | CL2005 | |
| Fiber Optic Rotary Joint | Doric Lenses | FRJ-v4 | |
| Table 2. Supplies and equipment. |
References
- Magistretti, P., Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. , 389-413 (1999).
- Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
- Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
- Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
- Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
- Borbely, A. A., Achermann, P., Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. , 377-390 (2004).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
- Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
- Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
- El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
- Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
- Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
- Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).
- Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
- Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).
