Summary

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

Published: July 27, 2012
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Summary

この資料では、1つは、模倣することができるようにする方法について説明します。<emin vivoでの></emの>開発<em>ショウジョウバエ</emで>キノコ体<em> ex vivoで</em>培養系。

Abstract

我々は全体のショウジョウバエの脳のex vivoで培養する方法を説明します。これは急性の薬理学的介入と細胞プロセスのライブイメージングを可能にすることにより、細胞生物学と中央脳構造の開発を調査するための慢性的な遺伝子操作に対位法として使用することができます。技術の一例として、我々の研究室1から前の仕事は、以前に認識されていない細胞内コンパートメントは、 ショウジョウバエ中枢脳の軸索の軸索と細胞体のコンパートメントの間にあることが示されている。軸索起始部(AIS)2と呼ばれるこの区画の開発は、ニューロン特異的サイクリン依存性キナーゼ、Cdk5を依存するように遺伝的に示された。私たちは、Cdk5を特異的薬理学的阻害剤ロスコビチンとオロモウシン3野生型のショウジョウバエの幼虫の脳のex vivoでの治療はアクチン組織の急性変化を引き起こすこと、およびここに示す遺伝的にCdk5を活性を欠く変異体では見られた変化を模倣する細胞表面タンパク質Fasciclin 2の局在インチ

ex vivoでの培養技術の第二の例は、幼生から成体への変態期胚のキノコ体(MB)γニューロンの接続の改造のために提供されています。キノコ体は嗅覚学習とフライ4のメモリの中心であり、これらのγニューロンは成体の神経支配パターン5を確立するために後でタイムポイントでの再拡張に分岐して蛹開発中に、その軸索と樹状突起の枝を剪定します。 MBのこれらのニューロンのプルーニングは、エクジソン受容体B1 7で演技、エクジソン、ステロイドホルモンによって引き起こされるメカニズムによって、神経突起の分岐6のローカル変性を介して起こることが示され、それがの活性に依存しているされていますユビキチン-プロテアソームシステム6。 ex vivoでの培養の我々の方法は、bができますeはさらに発達リモデリングのメカニズムを調べるために使用されます。我々は、ex vivoで培養設定では、MBのγニューロン in vivoと同様時間経過とともに発達剪定の過程をrecapitulatedことがわかった。それは変態と不可逆的にコミットするために細胞ために組織をexplanting前蛹殻形成後1.5時間まで待つことが、不可欠であった。pupariation開始時の動物の解剖は、培養中のほとんど、あるいはまったく変態につながった。したがって、適切な修正を加えて、ex vivoで培養アプローチは中心的な脳の生物学の定常状態の側面だけでなく、動的な学習に適用することができます。

Protocol

メディアのA.の準備フィルター滅菌シュナイダーのショウジョウバエのメディアは、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったことで、完全なメディアを準備します。 メディアは毎回新鮮な準備する必要があります。また、事前に凍結メディアの新鮮なアリコートを各使用前に解凍することができます。 培養に先立って、メディアに10μg/ …

Discussion

突然変異と導入遺伝子の発現を含む組織の構造と機能の慢性的な遺伝子操作は、通常、分離するのは非常に困難である即効性と後期間接的な結果の組み合わせを生成します。薬理学と遺伝学的手法を補完する表現型の背後にある時間経過の取り調べを容易にすることができます。たとえば、これはショウジョウバエの 10の精子形成時に異なる細胞骨格成分の寄与を解剖す?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、原稿上でのアドバイス、有用な議論やコメントのために我々の研究室のメンバー全員に感謝したい。我々はまた、特に我々が改造実験で培養するための脳を解剖する前に、APF 1.5時間まで待つという優れた提案のためにマルタコッホとBassemハッサンに感謝します。我々はまた、共焦点顕微鏡を使用するためのNHGRIのイメージング機能を感謝します。この作品は、NINDS学内研究プログラムは、NIH(Z01 NS003106)の基本的な神経科学プログラムによってサポートされていました。

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Final Concentration
Schneider’s Drosophila Media Invitrogen 21720-024  
Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) Invitrogen 10082-147 10%
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 1%
Insulin Invitrogen 12585-014 10μg/ml
Ecdysone Sigma-Aldrich H5142 2μg/ml
Roscovitine Sigma-Aldrich R7772 100μM
Olomoucine Sigma-Aldrich O0886 100μM
Normal Goat Serum Invitrogen 50062Z 1%
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific M9501 1%
Formaldehyde Sigma-Aldrich D4551 4%
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151 0.5%
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 70011-044 1X
Vectashield Vector Laboratories H1000  
Millicell Cell Culture Inserts Millipore PI8P01250  
Multidish, 4 well Thermo Scientific 176740  
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20  
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7  
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5M  

References

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Cite This Article
Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (65), e4270, doi:10.3791/4270 (2012).

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