אקס culturing vivo של שלם, פיתוח המוח תסיסנית
Summary
מאמר זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניתן לחקות<em> In vivo</em> פיתוח<em> תסיסנית</em> פטריות הגוף<em> לשעבר vivo</em> מערכת התרבות.
Abstract
אנו מתארים שיטה culturing vivo לשעבר של שלמות המוח תסיסנית. זה יכול לשמש משקל נגד כדי מניפולציות גנטיות כרוניות על חקירת ביולוגיה של התא ופיתוח של מבנים מוחיים מרכזיים בכך שהוא מאפשר התערבויות תרופתיות חריפות הדמיה חיה של תהליכים תאיים. כדוגמה טכניקה, לפני לעבוד במעבדה שלנו 1 הראה כי תא subcellular מוכרים קודם לכן נמצא בין התאים axonal ו somatodendritic של אקסונים במוח תסיסנית המרכזית. הפיתוח של תא זה, המכונה במגזר האקסון הראשון (AIS) 2, הוצגה גנטית תלוי קינאז נוירון ספציפי cyclin תלוי, Cdk5. אנחנו מראים כאן כי טיפול vivo לשעבר של wild-type המוח תסיסנית הזחל עם Cdk5 ספציפי מעכבי תרופתי roscovitine ו olomoucine 3 גורמת לשינויים חריפים בארגון אקטין, ובלוקליזציה של חלבונים על פני קרום התא Fasciclin 2, המחקים את השינויים הנראים מוטנטים חסרי Cdk5 פעילות גנטית.
דוגמה 2 של הטכניקה vivo לשעבר התרבות מסופק שיפוץ של קשרים של הגוף פטריות עובריים (MB) נוירונים גמא במהלך המטמורפוזה של הזחל לבוגר. גוף הפטרייה הוא מרכז למידה חוש הריח וזיכרון זבוב 4, אלה הנוירונים גמא לגזום ענפים axonal ו הדנדריטים שלהם במהלך פיתוח גלמי ואז שוב להאריך סניפים בכל timepoint מאוחר יותר לקבוע את דפוס העצבוב מבוגרים 5. גיזום של נוירונים אלה של MB הוכח להתרחש באמצעות ניוון המקומי של הענפים neurite 6, על ידי מנגנון זה מופעלת על ידי ecdysone, הורמונים סטרואידים, הפועל על הקולטן ecdysone B1 7, וכי היא תלויה בפעילות של ubiquitin-הפרוטאזום המערכת 6. השיטה שלנו של culturing vivo לשעבר יכול בדואר רגיל לחקור עוד יותר את המנגנון של שיפוץ התפתחותית. מצאנו כי הגדרת vivo לשעבר התרבות, הנוירונים גמא של MB סיכמו את תהליך גיזום התפתחותית כמובן עם הזמן בדומה in vivo. זה היה חיוני, עם זאת, לחכות עד 1.5 שעות לאחר היווצרות puparium לפני explanting את הרקמה על מנת התאים להתחייב באופן בלתי הפיך על מטמורפוזה, דיסקציה של בעלי חיים עם תחילת pupariation הוביל מטמורפוזה קטנה או לא בתרבות. לכן, עם שינויים מתאימים, גישה לשעבר התרבות vivo ניתן ליישם ללמוד דינמי כמו גם היבטים למצב יציב של הביולוגיה מוח מרכזי.
Protocol
Discussion
מניפולציות גנטיות כרוניות של מבנה ותפקוד רקמות, כולל מוטציות וביטוי transgenes, בדרך כלל ליצור שילוב של השפעות מיידיות ותוצאות עקיפות מאוחר זה יכול להיות מאוד קשה להיפרד. משלימים שיטות גנטיות עם פרמקולוגיה יכול להקל על החקירה כמובן זמן מאחורי פנוטיפ. כך, למשל, זה כבר ג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לכל אנשי המעבדה שלנו, עצות שלהם דיונים והערות מועילות על כתב היד. אנו גם רוצים להודות במיוחד מרתה קוך באסם חסן על ההצעה מצוין כי אנחנו מחכים עד 1.5 שעות APF לפני לנתח מוחות עבור culturing בניסויים שיפוץ. כמו כן, אנו מודים מתקן הדמיה NHGRI לשימוש של מיקרוסקופ confocal שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית Neuroscience בסיסי של תוכנית המחקר NINDS המיפוי, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Final Concentration |
| Schneider’s Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Scientific | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
