Summary

Ex vivo Kultivierung von Whole, Entwickeln von Drosophila Brains

Published: July 27, 2012
doi:

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine Methode, durch die man nachahmen kann<em> In-vivo-</em> Entwicklung der<em> Drosophila</em> Pilzkörper in ein<em> Ex vivo</em> Kultur-System.

Abstract

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex-vivo-Kultivierung von Drosophila ganze Gehirn. Dies kann als Kontrapunkt zu chronischen genetische Manipulationen zur Untersuchung der Zellbiologie und der Entwicklung der zentralen Gehirnstrukturen, indem akute pharmakologische Interventionen und Live-Imaging von zellulären Prozessen verwendet werden. Als ein Beispiel für die Technik, vor aus unserem Labor ein Arbeiten haben gezeigt, dass ein bisher nicht berücksichtigter subzellulären Kompartiment zwischen den Axonen und somatodendritischen Fächer von Axonen des zentralen Drosophila Gehirn liegt. Die Entwicklung dieser Kammer, die als das Axon ersten Segment (AIS) 2, wurde genetisch auf dem Neuronen-spezifischen Cyclin-abhängige Kinase, Cdk5 abhängen gezeigt. Wir zeigen hier, dass Ex-vivo-Behandlung von Wildtyp Drosophila Larve Gehirn mit dem Cdk5-spezifische pharmakologische Inhibitoren Roscovitin und Olomoucin 3 akuten Veränderungen im Aktin-Organisation verursacht, undin Lokalisation des Zelloberflächenprotein Fasciclin 2, die die Änderungen in Mutanten, die Cdk5 Aktivität fehlt genetisch gesehen zu imitieren.

Ein zweites Beispiel für die Ex-vivo-Kultur Technik wird für Umbau der Verbindungen von embryonalen Pilzkörper (MB) Gamma-Neuronen während der Metamorphose von der Larve zum erwachsenen Verfügung gestellt. Der Pilzkörper ist das Zentrum des olfaktorischen Lernen und Gedächtnis in-the-fly 4, und diese Gamma-Neuronen beschneiden ihre Axonen und Dendriten Filialen während der gesamten Entwicklung und dann wieder verlängern Zweige zu einem späteren Zeitpunkt, um die erwachsenen Innervationsmuster 5 zu etablieren. Beschneiden dieser Neuronen des MB hat sich gezeigt, über lokale Degeneration von Neuriten Zweigen 6 auftreten, durch einen Mechanismus, durch Ecdyson, ein Steroidhormon, ausgelöst wird, prüft auf Ecdyson-Rezeptor B1 7, und das ist abhängig von der Aktivität der Ubiquitin-Proteasom-System 6. Unsere Methode der Ex-vivo-Kultivierung kann be verwendet werden, um weiter zu befragen, den Mechanismus der Entwicklungspsychologie Umbau. Wir fanden, dass in der ex vivo-Kultur Einstellung, Gamma-Neuronen des MB den Prozess der Entwicklung Beschneiden rekapituliert mit einem zeitlichen Verlauf ähnlich der in vivo. Es war jedoch wesentlich, um bis 1,5 Stunden nach Puparium Bildung vor Explantation des Gewebes, damit die Zellen irreversibel zu verpflichten, Metamorphose warten; Sezierung von Tieren zu Beginn der Puparium führten zu wenig oder gar keine Metamorphose in der Kultur. So, mit entsprechender Modifikation kann die Ex-vivo-Kultur-Ansatz angewendet, um zu studieren dynamische als auch stationäre zentrale Aspekte der Biologie des Gehirns werden.

Protocol

A. Herstellung der Medien Planen kompletten Medien durch das Filter-Sterilisation Drosophila Schneider Medien, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin. Die Medien sollten jedes Mal frisch zubereitet werden. Alternativ kann ein frisches Aliquot der vorgefrorene Medien vor jedem Gebrauch aufgetaut werden. Vor der Kultivierung, fügen Sie 10 pg / ml Insulin und 2 pg / ml Ecdyson zu den Medien. Die Medikamente wurden als konzentrierte Bestände vorbereit…

Discussion

Chronische genetische Manipulationen von Gewebe Struktur und Funktion, einschließlich Mutationen und Expression von Transgenen, erzeugen in der Regel eine Kombination aus sofortiger Wirkung und späten indirekte Folgen, die nur sehr schwer zu trennen sind. Als Ergänzung zu genetischen Methoden können mit Pharmakologie erleichtern Verhör des zeitlichen Verlaufs hinter einem Phänotyp. Zum Beispiel, war dies ein starker Ansatz zum Präparieren der Beiträge der verschiedenen Komponenten des Zytoskeletts während…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten alle Mitglieder der Arbeitsgruppe für die Beratung, die hilfreichen Diskussionen und Kommentare zum Manuskript danken. Wir würden uns auch besonders gerne Marta Koch und Bassem Hassan für den ausgezeichneten Vorschlag, dass wir warten, bis 1,5 Stunden vor dem Sezieren APF Gehirne für die Kultivierung im Umbau Experimente danken. Wir danken auch dem NHGRI bildgebenden Einrichtung für die Nutzung ihrer konfokalen Mikroskop. Diese Arbeit wurde von der Basic Neuroscience Program der NINDS Intramural Research Program, NIH (Z01 NS003106) unterstützt.

Materials

Name of Reagent Company Catalog Number Final Concentration
Schneider’s Drosophila Media Invitrogen 21720-024  
Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) Invitrogen 10082-147 10%
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 1%
Insulin Invitrogen 12585-014 10μg/ml
Ecdysone Sigma-Aldrich H5142 2μg/ml
Roscovitine Sigma-Aldrich R7772 100μM
Olomoucine Sigma-Aldrich O0886 100μM
Normal Goat Serum Invitrogen 50062Z 1%
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific M9501 1%
Formaldehyde Sigma-Aldrich D4551 4%
Triton-X 100 Fisher Scientific BP151 0.5%
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 70011-044 1X
Vectashield Vector Laboratories H1000  
Millicell Cell Culture Inserts Millipore PI8P01250  
Multidish, 4 well Thermo Scientific 176740  
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20  
Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-7  
Cover Glass Fisher Scientific 12-548-5M  

References

  1. Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
  2. Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
  3. Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
  4. Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
  5. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
  6. Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
  7. Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
  8. Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
  9. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
  10. Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
  11. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
  12. Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
  13. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).

Play Video

Cite This Article
Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (65), e4270, doi:10.3791/4270 (2012).

View Video