Preparação de<em> Drosophila</em> Os neurônios centrais para<em> In situ</em> Patch aperto
Summary
No patch situ gravações de fixação são usados para a caracterização eletrofisiológica dos neurônios no circuito intacto. No modelo genético Drosophila patch clamping é difícil, porque o SNC é pequeno e está rodeado por uma bainha robusto. Este artigo descreve o procedimento para remover os neurônios bainha e limpa para gravações posteriores braçadeira de patches.
Abstract
Tempos de geração curtos e fáceis técnicas genéticas fazer a mosca da fruta Drosophila melanogaster um modelo excelente genética na pesquisa em neurociência fundamental. Canais iônicos são a base de todo o comportamento uma vez que medeiam a excitabilidade neuronal. O primeiro canal de iões de tensão gated clonado era a tensão Drosophila canal de potássio gated Shaker 1,2. Para a compreensão do papel dos canais iônicos e excitabilidade de membrana para a função do sistema nervoso é útil para combinar poderosas ferramentas genéticas disponíveis em Drosophila em gravações com braçadeira situ patch. Durante muitos anos, tais gravações foram dificultados pelo pequeno tamanho do CNS de Drosophila. Além disso, uma bainha resistente feita de colagénio e células gliais constituído obstáculos para o acesso à @ patch pipette @ neurónios centrais. A remoção desse revestimento é uma condição necessária para gravações de patch clamp de qualquer neurônio no SNC adultos de Drosophila. Nos últimos anosos cientistas foram capazes de conduzir em gravações de fixação in situ de patch de neurônios no cérebro adulto 3,4 e cordão nervoso ventral embrionário 5,6, 7,8,9,10 larval e adulto Drosophila 11,12,13,14. Um estábulo giga-seal é a principal condição prévia para um bom patch e depende de contacto perfeito da pipeta remendo com a membrana celular a fim de evitar as correntes de fuga. Portanto, para a célula inteira em gravações de patch situ braçadeira de neurônios adultos de Drosophila deve ser bem limpo. No primeiro passo, a bainha ganglionar tem de ser tratado enzimaticamente e removido mecanicamente para tornar as células alvo acessíveis. No segundo passo, a membrana da célula tem de ser polida, de modo que nenhuma camada de material de colagénio glia, ou outro pode perturbar giga-seal formação. Este artigo descreve como preparar um neurônio central identificada no cordão nervoso ventral Drosophila, o motoneurônio vôo 5 (MN5 15), para todo c somáticaell gravações patch clamp. Identificação e visibilidade do neurónio é alcançado através da expressão da GFP específica de MN5. Nós não têm o objetivo de explicar a técnica patch clamp si.
Protocol
Discussion
Quando a visualização das células com proteínas fluorescentes como GFP, é importante não sobre-exposição da preparação a muita luz. Isto pode resultar em dano da foto. Usamos 100W HBO lâmpadas de mercúrio de arco curto para iluminação, e também usamos de densidade neutra (ND) de 0,8 (filtros ND Chroma 0,3 e 0,5). Para ser capaz de avaliar a qualidade da limpeza boa visibilidade é crucial. Por conseguinte, os filtros podem ser removidos ND por curtos períodos de cerca de 20 s para múltiplas vezes.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
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