إعداد<em> ذبابة الفاكهة</em> الخلايا العصبية المركزي لل<em> في الموقع</em> تصحيح لقط
Summary
في التصحيح الموقع وتستخدم لتوصيف المشبك التسجيلات الكهربية للخلايا العصبية في الدوائر سليمة. في ذبابة الفاكهة الوراثية نموذج التصحيح تحامل صعب لأن CNS صغيرة ومحاطة غمد قوية. توضح هذه المقالة الإجراء لإزالة الخلايا العصبية وغمد نظيفة لاحقة التسجيلات المشبك التصحيح.
Abstract
أوقات قصيرة الجيل والتقنيات الوراثية السهل جعل ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا نموذجا ممتازا في مجال البحوث الجينية علم الأعصاب الأساسية. القنوات الأيونية هي أساس كل سلوك لأنها توسط استثارة الخلايا العصبية. كان أول قناة أيون الجهد بوابات المستنسخة الجهد ذبابة الفاكهة قناة البوتاسيوم بوابات شاكر 1،2. نحو فهم دور القنوات الأيونية واستثارة الغشاء وظيفة الجهاز العصبي من المفيد الجمع بين أدوات الجينية القوية المتاحة في ذبابة الفاكهة في الموقع مع التسجيلات المشبك التصحيح. لسنوات عديدة وتعطلت هذه التسجيلات من صغر حجم الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة. وعلاوة على ذلك، يشكل غمد قوية مصنوعة من الكولاجين والخلايا الدبقية العقبات للوصول إلى الخلايا العصبية ماصة التصحيح المركزية. إزالة هذا الغلاف هو شرط مسبق ضروري للتسجيلات المشبك التصحيح من أي الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة الكبار. في السنوات الأخيرةكان العلماء قادرين على إجراء التسجيلات في الموقع المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الدماغ البالغ 3،4 بطني والحبل العصبي الجنيني 5،6، 7،8،9،10 اليرقات، وذبابة الفاكهة الكبار 11،12،13،14. A مستقر جيجا ختم هو الشرط المسبق الأساسي لتصحيح جيد ويعتمد على الاتصال نظيفة للماصة التصحيح مع غشاء الخلية لتجنب تسرب التيارات. لذلك، يجب أن لخلية كاملة في الموقع التسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة الكبار تنظيفها جيدا. في الخطوة الأولى، وغمد العقدية لابد من معالجة إنزيمي وإزالة ميكانيكيا لجعل الخلايا المستهدفة للوصول. في الخطوة الثانية، غشاء الخلية لابد من مصقول بحيث لا طبقة من المواد الدبقية، والكولاجين أو غيرها قد تخل جيجا ختم التشكيل. توضح هذه المقالة كيفية إعداد الخلايا العصبية التي تم تحديدها في العصب المركزي ذبابة الفاكهة الحبل البطني، والعصبون الحركي رحلة 5 (MN5 15)، لج جسدية كاملةتسجيلات الذراع التصحيح المشبك. ويتحقق تحديد وتسليط الضوء على الخلايا العصبية المستهدفة من التعبير GFP في MN5 من. نحن لا نهدف إلى شرح تقنية المشبك التصحيح نفسه.
Protocol
Discussion
عندما تصور الخلايا مع البروتينات الفلورية مثل GFP، من المهم عدم الإفراط في تعريض إعداد للضوء أكثر من اللازم. وهذا قد يؤدي إلى تلف الصورة. نستخدم 100W HBO الزئبق قوس قصيرة المصابيح لإضاءة، ونحن أيضا استخدام الكثافة المحايدة (ND) 0.8 (الفلاتر ND صفاء 0.3 و 0.5). لتكون قادرة على الحكم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Agent/item | Company | Catalog number |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT |
| ND filter set (unmounted) | Chroma | 22000b series |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O’Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
