פלואורני<em> באתר</em> הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

1. הכנת כרומוזום זחלי יתושים גודלו באמצעות פרוטוקול סטנדרטי המתוארים בשיטות מחקר באנופלס זמין באתר האינטרנט של מחקר המלריה ומרכז משאבים מגיבים עיון (MR4) 13. הטמפרטורות של גידול יתושים שונו כדי לספק את המספר הגבוה ביותר של הכרומוזומים בדיסקים דמיוניים ותמותה הנמוכה ביותר של הזחלים. שלבי התפתחות זחלי יתושים נקבעו על בסיס את הגדלים של 13 כמוסות ראשם. ביצי יתושי האץ' ב28 מעלות, ולאחר 2-3 ימים, 2 nd או העברת זחלי 3 rd instar עד 16 מעלות צלזיוס במשך Ae. aegypti וCx. quinquefasciatus ועד ​​22 מעלות צלזיוס במשך. gambiae. 4 בזחלי מקום instar על קרח לכמה דקות לקיבוע. העברת זחל לשקופית עם ירידה של פתרון hypotonic קר (0.5% כךציטראט dium או כלוריד 0.075 M אשלגן), והנח אותו מתחת למיקרוסקופ סטריאו. בחר זחל עם תעודות סגלגלות (האיור 1B) לנתיחה נוספת. לערוף זחל, וחתך את הציפורן מצד הגחון של בית החזה באמצעות מספרי הזחל מבתרים (איור 2 א). הפוך קיצוץ נוסף במגזר שני או שלישי בטן לנתח את המעיים מהזחל. את הכיוונים של הקיצוצים מוצגים באמצעות חיצים. פתח את הציפורן, ולהסיר את המעיים ושומן בגוף מהזחל. הסר את פתרון hypotonic מהשקופית באמצעות נייר סינון, ולהוסיף טיפה טריה של פתרון hypotonic ישירות למזהים (איור 2 ב '). שמור זחל בפתרון hypotonic עבור 10 דקות ב RT. הסר פתרון hypotonic באמצעות נייר סינון, וליישם הפתרון של Carnoy (אתנול / חומצה אצטית ביחס 3:1). לאחר הוספת פתרון מקבע, IDS פונה מייד לבן ולהיות גלויים בקלות מתחת למיקרוסקופ (האיור 2C </sטרונג>). השימוש במחטים מבתרות, להסיר מזהים מהזחל (האיור 2D), ולהעביר אותם לירידה של חומצת propionic 50%. הסר את כל רקמות אחרות, כגון מעיים ושומן בגוף, מהשקופית. כיסוי מזהים עם תלוש כיסוי 22×22 unsiliconized, ולשמור על 10 דקות ב RT. כסה את השקופית עם נייר סינון, וקישואי רקמות על ידי קשה על המחק של עיפרון על ההיקף של תלוש הכיסוי. בקצרה לנתח את האיכות של השקופית באמצעות מיקרוסקופ שלב הניגוד ב100x או 200x גדלה (איור 3). תכשירים ה> 50 מרווחי כרומוזום יכולים להיחשב מתאים לדגים. לטבול ולהחזיק את השקופית בחנקן נוזלי עד שייעצר מבעבע. הסר את הכיסוי מתלוש השקופית באמצעות סכין גילוח, ולהעביר את השקופית מייד למכל של 70% אתנול הקר ב -20 ° C. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך שעות לפחות 1 לתוצאה הטובה ביותר ההתייבשות (אם יש צורך, שקופיות ניתן לאחסן ב-tהצעד מכמה דקות עד מספר ימים). מייבש שקופיות בסדרה של אתנול (70%, 80%, 100%) ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כל אחד, ואוויר יבש בRT. אחסן מגלשות יבשות ב -20 ° C לפני ניצולם לדגים. 2. חילוץ של שברי DNA חוזרים ביצוע דגים של בדיקת DNA שיבוט BAC על כרומוזומים מAe. aegypti וCx. quinquefasciatus דורש באמצעות שברי DNA חוזרים ללא תווית לחסום הכלאה נוקבת של DNA חוזר לכרומוזומים. האיחוד מחדש של ה-DNA הגדיל DNA הבודד מתפצל לחתיכות של כמה מאה נ"ב עוקב עקום 0 C t כאשר C 0 הוא הריכוז הראשוני של גדילי דנ"א יחיד ולא פעם reannealing. שברי DNA עם ערכי שוויון עד 10 -10 -1 -4 או 10 ° -10 C0t 2 נחשבים מאוד מתון וחוזר על עצמו, בהתאמה. חלץ 400-500 מיקרוגרם של הדנ"א הגנומי מיתוש בוגר באמצעות דם Qiagen וMaxikit תא תרבות, ולהכין את פתרון ה-DNA בμl 1.2x SSC 100-1,000 ng /. דנ"א לפגל על ​​ידי נחת צינור בטוח נעילה עם הדנ"א הגנומי לבלוק חימום prewarmed עד 120 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. טמפרטורה גבוהה מסייעת לנעה DNA ל200-500 ברי BP. בהתאם לריכוז ה-DNA, לשייך מחדש דנ"א על ידי נחת הצינור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 15-150 דקות כדי להשיג את שברי 0 C t-DNA ל-C 0 t3 (טבלה 1). הנח את הצינור עם DNA על קרח 2 דקות. העבר את ה-DNA עד 42 מעלות צלזיוס, להוסיף S1 nuclease חיץ 10x חומם מראש וS1 nuclease לריכוז סופי של 100 U ל1 מ"ג של ה-DNA, ודגירה במשך שעה 1. דנ"א משקע על ידי הוספת נפח 0.1 יצטט M 3 נתרן ונפח 1 מתוך isopropanol בRT. צנטריפוגה בסל"ד 14000 עבור 20 דקות ב 4 ° C. שטוף DNA באתנול 70%, ושוב בסרכזת 14000 סל"ד למשך 10 דקותב 4 ° C. להתייבש באוויר ולפזר DNA גלולה בחיץ TE. למדוד את ריכוז ה-DNA, ולדמיין על ידי אלקטרופורזה ג'ל. בדרך כלל הכמות הסופית של שברי DNA חוזרים מייצגת 35-50% מסכום DNA המקורי. 3. דנ"א Probe תיוג שני פרוטוקולים שונים שמשו לתיוג BAC שיבוט DNA הבדיקה ובדיקת rDNA IGS. תיוג שיבוט 3.1 BAC להשתמש בכינוי-תרגום לחלץ דנ"א שיבוט BAC מספריית BAC באמצעות ערכת Construct גדולה Qiagen. הכן תערובת תגובה על תיוג כינוי-תרגום על קרח עם נפח סופי של 50 μl: 1 מיקרוגרם המבודד BAC השיבוט דנ"א, 0.05 מ"מ כל אחד ללא תווית dATP, dCTP, וdGTP ו0.015 מ"מ של dTTP; μl 1 מתוך Cy3-dUTP (או אחר fluorochrome); 0.05 מ"ג / מיליליטר BSA, 5 μl של חיץ 10x nick-תרגום, 20 U של ה-DNA פולימרז, ו0.0012 U של DNase. לדגור על 15 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות. עצור תגובה על ידי הוספת μl 1 מתוך 0.5 מ 'EDTA. חללית החנות ב -20 ° C במקום חשוך. 3.2 IGS rDNA תיוג באמצעות PCR הכן תערובת תגובה על קרח עם נפח סופי של 50 μl: 200 ננוגרם של הדנ"א הגנומי; 0.05 מ"מ כל אחד ללא תווית dATP, dCTP, וdGTP; 0.015 מ"מ של dTTP; μl 1 מתוך Cy3-dUTP (או אחר fluorochrome); 5 μl של 10x PCR-חיץ; 50 pmol של קדימה; האו"ם (GTGTGCCCCTTCCTCGATGT) ולהיפך; פריימרים GA (CTGGTTTGGTCGGCACGTTT) להגברת IGS; ו10 U של פולימראז תקי DNA 14. מבצע תגובת PCR באמצעות פרמטרי PCR רגילים להגברת IGS: 95 מעלות צלזיוס / 5 דקות x 1 מחזור; (95 מעלות צלזיוס / 30 שניות, 50 מעלות צלזיוס / 30 שניות, 72 ° C / 30 שניות) x 30 מחזורים; 72 ° C / 5 דקות מחזור x 1, ו 4 ° C מחזיקים 14. חללית החנות ב -20 ° C במקום חשוך. 4. פלורסנט כלאה באתר <eמ '> פרוטוקול דגים זה כולל שתי וריאציות: 1 לבאמצעות DNA השיבוט BAC כמו בדיקה על כרומוזומים mitotic של AE. aegypti וCx. quinquefasciatus והשני לשימוש rDNA IGS על כרומוזומים mitotic של. gambiae. אם באמצעות בדיקות DNA שיבוט BAC, טיפול RNase דלג על שלבי 4.3, 4.4, וצעד שקופית / בדיקה סימולטנית denaturation 4.19. אם אתם משתמשים בIGS rDNA חללית, להכין תערובת הכלאה בלי 0 שברי DNA t C, ולדלג על שקופית / בדיקה נפרדת denaturing צעדים 4.10, 4.11, 4.16, 4.17 ו. דגירת שקופיות ב2x SSC למשך 30 דקות ב 37 ° C. מייבש שקופיות בסדרה של 70%, 80%, ו 100% אתנול למשך 5 דקות בכל RT, ואוויר יבש. אם ביצוע דגים עם BAC השיבוט DNA, להמשיך ישירות לשלב 4.5. דגירת הכנת כרומוזום ב0.1 מ"ג / מיליליטר RNase פתרון תחת parafilm למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף פעמים ב2x SSC למשך 5 דקות כל אחד ב 37 ° C. שים את השקופיות אנינה צנצנת עם 0.037% פתרון HCl פפסין 0.01% ו, ודגירה במשך 5 דקות בשעת 37 ° C. שטוף את השקופיות ב1x PBS למשך 5 דקות בRT. תקן הכנת כרומוזום בצנצנת עם 1% פורמלין ב1x PBS הוכן מ10% ניטראליים שנאגר פורמלין למשך 10 דקות בRT. שטוף את השקופיות ב1x PBS למשך 5 דקות בRT. מייבש שקופיות בסדרה של 70%, 80%, ו 100% אתנול למשך 5 דקות בכל RT, והכנות אוויר יבשות על 37 ° C. אם מבצע FISH עם IGS, להמשיך ישירות לשלב 4.12 שקופיות לפגל בצנצנת עם פוראמיד 70% prewarmed עבור 2 דקות ב 72 ° C. מייבש שקופיות בסדרה של קר (-20 מעלות צלזיוס) 70%, 80%, ו 100% אתנול למשך 5 דקות כל אחד, ואוויר יבש ב 37 ° C. הכן תערובת הכלאה: 5. Μl בדיקה של DNA שכותרת מהשלב 3, 10 μl של DNA C 0 t מ שלב 2 עם ריכוז סופי של 0.5 μl ng / μl, ו 5 של מיקרוגרם 1 / DNA הזרע μl sonicated סלמון לדגים עם IGS rDNA, להכיןתערובת הכלאה בלי 0 שברי DNA t C. דנ"א משקע על ידי הוספת נפח 0.1 יצטט M 3 נתרן ו2 כרכים של אתנול. שמור ב -20 ° C ל1-3 שעות. צנטריפוגה בסל"ד 14000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, הסר את אתנול, ואוויר יבש בגלולת RT. יסודיות לפזר את הגלולה ב10 μl של חיץ הכלאה: 50%. פוראמיד, 20% סולפט dextran, 2x SSC אם ביצוע דגים עם IGS, להמשיך ישירות לשלב 4.18 תערובת הכלאה לפגל ל7 דקות ב97 מעלות צלזיוס, ומייד לשים על קרח לדקה 1. Prehybridize תערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, כדי למנוע הכלאה נוקבת של DNA החוזר לכרומוזומים. הנח 10 μl של תערובת ההכלאה בשקופית, ומכסים בתלוש כיסוי 22×22. למנוע היווצרות בועות – בועות אוויר יש להסיר עם לחץ קל לביצוע coverslip אם דגים עם DNA השיבוט BAC, להמשיך ישירות לשלב 4.20 <./ Em> לפגל בדיקת דנ"א וכרומוזום בו זמנית באמצעות בלוק חימום ב 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. תלוש כיסוי דבק סביב היקף שימוש בבטון גומי. בצע הכלאה בין הלילה בתא לח ב 37 ° C. הסר מלט גומי וcoverslip מהשקופית. 2 דקות לשטוף שקופית בפתרון prewarmed 1 (0.4x SSC, 0.3% Nonidet-P40) בשעת 73 ° C. שטוף את השקופיות בפתרון 2 (2x SSC, 0.1% Nonidet-P40) למשך 5 דקות בRT. Counterstain שקופית באמצעות 0.001 מ"מ YOYO-1 ב1x PBS עבור 10 דקות בתא לח בRT. הר בכמות קטנה של מגיב להאריך antifade זהב עם פתק כיסוי. נתח את ההכנות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות קובע מסנן מתאים בהגדלת 1000 x (איור 4). 5. נציג תוצאות מזהי חרקים נמצאים בכל קטע של הזחל. בהתאם למיקום, הey להפוך לרקמות שונות בשלב הבוגר של החרק. המזהים, המשמשים להכנת כרומוזום בפרוטוקול זה, להתפתח לרגליים בשלב הבוגר של היתוש. תעודות אלה ממוקמים בצד הגחוני של בית החזה והזחל הן בבירור מבעד לציפורן מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בתחילת שלב ה 4 instar זחל, מזהים יש צורה עגולה (איור 1 א). המספרים הגדולים ביותר של מיטוזה, ~ 175 באחד 9 זהות, נצברים בשלב מאוחר יותר "סגלגל בצורה" (האיור 1B), שיש לקחת בחשבון את השלב האופטימלי להכנת שקופית. בשלב זה, מזהה ביניים מתפצל לשתיים: 1 הופך לרגל ועוד אחד הופך לכנף. אנחנו מעדיפים להשתמש במזהי הרגל הגדולים בשלב "הסגלגל" לשקופית הכנת כרומוזום. התרשים 1C מייצג מזהים בשלב האחרון של פיתוח 4 זחל instar ה. בשלב זה,מזהים כבר התפתחו לרגליים וכנפיים, ומכילים כמות משמעותית של רקמות בדיל ומספר נמוך של מיטוזה. שלב זה של התפתחות זהות יש להימנע לשקופית הכנת כרומוזום. אנו ממליצים גם זחלי יתושי גידול בטמפרטורות נמוכות: 16. מעלות צלזיוס במשך Aedes וCulex ו 22 מעלות צלזיוס במשך אנופלס זה עוזר להגדיל את כמות מיטוזה במזהים 9. איור 2 מדגים נתיחת זיהוי מבית החזה של 4 זחל instar ה. בגלל הציפורן של חרק חי קשה לנתח, מומלץ להשתמש במספריים מבתרים במקום את המחטים נפוצות להכנת זחל. ההליך החיוני ביותר להשגת הכנת כרומוזום באיכות גבוהה הוא טיפול הפתרון hypotonic. לקבלת תוצאות הטובות ביותר, אנו מסירים את המעיים ושומן בגוף מחזה הזחל לפני טיפול זה. נפיחות של התאים הזהים במהלך הליך זה עוזר להפיץ כרומוזוםזה בשקופית (איור 3 א). האיכות המתאימה לטיפול פתרון hypotonic ניתן לזהות בקלות על ידי צורתו העגולה של תאים בהכנות (איור 3 א ', ב'). תאים עם צורת אליפסה מעידים טיפול פתרון hypotonic מספיק (האיור 3C). כדי להיבחר לדגים, הכנת כרומוזום צריכה להכיל לפחות 50 מרווחי כרומוזום באיכות גבוהה. בדרך כלל, ~ 90% מהשקופיות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה יש איכות מספיקה לדגים 9. אנו מציגים שני פרוטוקולי דגים שונים במקצת: פרוטוקול מתקדם לדגים באמצעות בדיקת DNA גנומי BAC שיבוט על כרומוזומים mitotic של Aedes וCulex ופרוטוקול דגים פשוט לIGS rDNA חללית על כרומוזומים mitotic של אנופלס. הגנומים של Aedes וCulex הם חוזרים על עצמו מאוד בגלל ייצוג היתר של אלמנטי transposable 7,8. לפיכך, ביצוע דגים, ut שilizes DNA השיבוט BAC הגנומי כמו בדיקה, דורש הוספת שברי DNA חוזרים ללא תווית לחללית כדי לחסום הכלאה נוקבת של DNA חוזר לכרומוזומים. להפקה את שברי DNA החוזרים, הדנ"א הגנומי הוא מפוגל ב 120 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. דנ"א רותח בטמפרטורה גבוהה גם עוזר להשיג DNA בברי 200-500 נקודתי בסיס. דנ"א מותר לשייך מחדש לאחר טיפול זה. שברי DNA החוזרים מאוד נוטים למצוא את בת הזוג שלהם לאיחוד מחדש מהר יותר מאשר ה-DNA ברצפים ייחודיים עושה. כתוצאה מכך, האיחוד מחדש של ה-DNA כדלקמן C 0 x עקומת t כאשר C 0 הוא הריכוז הראשוני של גדילי דנ"א יחיד, ולא בפעם reannealing. שברי DNA עם 0 C ערכים שווים ל10-4 T – 10-1 או 100-102 נחשבים מאוד מתון וחוזרים על עצמו, בהתאמה. הזמן של האיחוד מחדש לשברי DNA 0 t C שונים ניתן לחשב באמצעות הדואר הנוסחא t = C 0 t-X × 4.98 / 0 C, שבו לא – הזמן של דגירה, C 0 t X – C 0 שבריר t (1 C0t = 1, C 0 t 2 = 2, וכו ') ו-C 0 – הריכוז ראשוני DNA במיקרוגרם / μl 15 (טבלה 1). לאחר איחוד מחדש, גדילי דנ"א יחיד מתעכל באמצעות S1 nuclease. אנחנו מעדיפים ובזבזנו את כל שברי DNA 0 t C ל-C 0 3 t יחד במקום שבריר הנפוץ C 0 t 1-DNA. C 0 שברי t אלה כוללים כמה מרצפי DNA מתון החוזרים ויחד מייצגים לרוב 35-50% מהסכום המקורי של הדנ"א הגנומי AE. aegypti. הפרופורציה הנכונה בין הבדיקה DNA שכותרת והשבריר ללא תווית C 0 t-DNA תלויה ברכיב ה-DNA בכל אחד חוזר על עצמו כפיל BAC מסוים. בממוצע, אנחנו משתמשים 1:20 לבדיקת C 0 tשיעור שבריר של DNA לצורך השיג אותות מקובלים / יחס רקע תוצאת הדגים. Prehybridization של הבדיקה DNA עם 0 שברי C t-DNA בצינור למשך 30 דקות לפני ההכלאה בפועל בשקופית גם עוזר להפחית רקע. תיוג, הכלאה עצמו, והשטיפה בפרוטוקול זה מבוצעים באמצעות תנאים סטנדרטיים 12. תוצאות הדגים של שתי בדיקות שכותרתו שונה BAC שיבוט DNA על כרומוזום mitotic של AE. aegypti וCx. quinquefasciatus הם מוצגים באיורי 4 א 'וב', בהתאמה. בדיקות DNA שיבוט BAC לייצר אותות חזקים בעמדה אחת בכרומוזומים. הכרומוזומים שמוצגים באיור 1 הם counterstained עם יודיד YOYO-1. צבע זה מייצר את הדפוסים התקבצו מיטב על AE. הכרומוזומים aegypti 9. לחלופין, צבעי ניאון אחרים, כגון DAPI או יודיד propidium, יכולים להיות מנוצלים עבור ההדואר counterstaining כרומוזום. לphotobleaching דיכוי של השקופיות, אנו משתמשים להאריך בינוניים גוברים antifade זהב. ריאגנט הזה יש יכולות שימור אות טובות וגם ניתן להסיר בקלות מהשקופית על ידי השטיפה ב1x PBS אם יש צורך להשתמש באותה השקופית במשך כמה הכלאות. גרסה פשוטה של פרוטוקול הדגים מיועדת להכלאה של IGS rDNA חללית על כרומוזומים mitotic של אנופלס. גני ריבוזומלי באנופלס מיוצגים כמקבץ רב צורות של גנים הממוקמים על כרומוזומי מין 16. בדיקת DNA בפרוטוקול זה מסומן באמצעות תגובת PCR סטנדרטית על ידי הוספה או Cy3 Cy5 dNTPs כותרתו fluorescently. בגלל חסימת הכלאה נוקבת של DNA החוזר בeuchromatin אינו נחוץ, כל הפעולות הקשורות לשימוש ב0 שברי DNA t C הושמטו. במקום זאת, הם הכנות כרומוזום pretreated עם RNase למניעת הכלאה של IGS rDNA החללית כדילגרעין. כרומוזומים ובדיקת DNA הם מפוגלים בו זמנית על ידי חימום השקופית יחד עם בדיקה במערכת הכלאה ב 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הכלאה ושטיפה בפרוטוקול זה גם בוצעו באמצעות תנאים סטנדרטיים לדגים 12. התוצאה של דגים מודגמת באיור 4C: פולימורפיזם של הכלאת IGS rDNA בין שני כרומוזומי X נראה בבירור. ריכוז ה-DNA מיקרוגרם / μl Reannealing זמן, דקות C 0 t 2 0.1 100 0.3 33 0.5 20 0.7 14 0.9 11 1 10 <tdrowspan = "6"> C 0 t 3 0.1 150 0.3 50 0.5 30 0.7 21 0.9 17 1 15 טבלה 1. ריכוז ה-DNA וזמני reannealing להכנת C 0 T2 ו C 0 שברי T3. איור 1 שלבים של פיתוח הזהות ב4 זחל instar ה:) מוקדמת "דמות עגולה" במה; ב ') שלב ביניים "סגלגל צורה" – אופטימלי להכנת כרומוזום; ג) בשלב מאוחר – לא ראוי להכנות כרומוזום. . עמדות מזהים מסומנות על ידי חצים בצד הגחוני של בית החזה הזחל. איור 2 צעדים של ביתור ID:) זחל ערוף (לכיוון קיצוצים מסומנים על ידי חיצים); B) זחלים עם בטן גזורה תחת טיפול פתרון hypotonic (מזהים להתנפח ולהפוך לכמעט בלתי נראה); C) זחל לאחר יישום הפתרון של Carnoy (. מזהים הפכו לבנים ונראה בבירור); ד) גזור מזהים בפתרון של Carnoy. עמדות של תעודות בזחל מסומנות באמצעות כוכביות. איור 3 איכויות שונות של ממרחים: כרומוזום) התפשטות כרומוזום מושלמת – צורה עגולה של התאים מדגימה טיפול מספק של תעודות הזהות בפתרון hypotonic; B) טיפול hypotonic מושלם – הכרומוזומים הם מעט undersquashed; C) התפשטות כרומוזום עניה. – התוצאה שלטיפול hypotonic מספיק מצוין באמצעות צורה סגלגלה של התאים. איור 4. דוגמאות לדגים עם שיבוטי BAC (A, B) וrDNA IGS (ג') בכרומוזומים של AE. aegypti (), Cx. quinquefasciatus (ב '), ו. gambiae (C). 1, 2 ו 3 – הם מספרים של כרומוזומים; X – כרומוזום מין נשי ב. gambiae.