의 세포 구체적인 분석<em> Arabidopsis</em> 형광 활성화 셀 정렬을 사용하여 잎

1. 원형질 세대 면도날과 1mm 폭 스트립 (그림 1)에 수확 잎 자료와 컷. 최대 15 잎에 하나의 잎보다 더 많은을 포함하는 샘플은 쉽게 절단하기 전에 스택 할 수 있습니다. 즉시 20 ML 솔루션을 포함 9cm 원형 페트리 접시에 잎 조각을 전송 (400 MM 마니 톨, 20 MM MES 하이드레이트, 20 MM KCl, 10 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 0.1 % BSA와 2.5 MM β-메르 캅토 에탄올, protoplasting 효소 (1.2 % 셀룰로오스 R-10, 0.6 % 셀룰로오스 RS와 0.4 % macerozyme R-10)와 RNase와 전사 억제제 (1 × ProtectRNA 10 μg / ML Actinomycin D) 등의 pH를 5.7)는, 부드럽게 잎 스트립을 분리하고 2 × 5 분에 침투 해를 진공 청소기. 궤도 셰이커에 장소 페트리 접시 3-4 시간을위한 공간 온도와 원형질 90 RPM으로 설정합니다. 부화 동안 잎 스트립은 사용하여 서로 구분되어야합니다이분의 일 매시간 간격으로, 평면 핀셋으로 설정합니다. 50 ML 튜브에 70 μm 셀 스트레이너 (피셔 과학)를 놓고 살짝 통해 protoplasting 솔루션을 필터링합니다. 이 protoplasts이 통과 할 수 있도록하면서 체에 의해 유지 될 잎 스트립을 제거합니다. 4 ML 솔루션 같은 체를 통해 조심스럽게 필터와 잎 스트립을 씻는다. 둥근 바닥 튜브에 protoplasts를 전송하고 펠릿 protoplasts 5 분 300 XG에서 원형질 솔루션을 원심 분리기. 부드럽게 protoplasts을 방해하지 않으면 서 많은 표면에 뜨는의 최대한을 대기음. 5 분 300 XG에서 5 ML 솔루션 및 원심 분리기로 protoplasts을 씻는다. 표면에 뜨는 제거 파스퇴르 피펫 또는 컷 – 오프 P1000 팁을 사용하여 솔루션의 적절한 볼륨에 protoplasts을 Resuspend. 2. 리프 Protoplasts의 FACS </p> 즉시 정렬하기 전에 함께 거리며 걷게 protoplasts을 피하기 위해 (비 절단) P1000 팁을 사용하여 protoplasts을 resuspend. 50 μm filcon 필터 (BD Biosciences)를 통해 정렬 관에 protoplasts를 전송하고 셀 정렬의 노즐을 막힘 방지하기 위해 적절한 희석. protoplasts 20 PSI (집)와 21-21.5 PSI (샘플), 39.2 kHz에서의 주파수의 압력과 <4000 (이러한 설정은 BD의 유입 셀 정렬에 최적의 아르의 행사 요금에 100 μm의 노즐을 사용하여 정렬됩니다 다른 셀 정렬 기계에 (BD Biosciences). 최적화 설정을 조정)을해야 할 수도 있습니다. GFP 긍정적 인 protoplasts은 488 nm의 아르곤 레이저를 사용하고 30분의 580 대역 통과 필터 (오렌지) 대 40분의 530 대역 통과 필터 (녹색)의 출력을 플로팅 식별됩니다. GFP 긍정적 인 protoplasts이 높은 580 popu에서 530 낮은 / 낮은 580 인구 죽은 / 죽어 protoplasts와 부스러기가 아닌 GFP의 protoplasts과 함께 높은 530/low 580 인구에있을 것입니다lation (그림 2). RNA가 추출됩니다있는 protoplasts를 정렬 할 때 protoplasts은 환원제를 포함하는 용해 버퍼의 최소 4 볼륨 (예 : β-메르 캅토 에탄올)에 직접 정렬해야합니다. 또한, 단일 샘플의 정렬 시간이 20-30 분,하고 한 번에 처리 2-3 샘플 최대로 제한해야합니다. 정렬 protoplasts의 시각화를 들어, protoplasts는 솔루션의 최소한 8 권과 이후 protoplasts을 집중 원심 분리에 의해 수집에 직접 정렬해야합니다. 3. 대표 결과 이 프로토콜은 형광 활성화 세포 정렬 (그림 1)에 사용되는 Arabidopsis 잎에서 protoplasts을 얻기위한 방법을 설명합니다. RNase와 전사 억제제의 존재의 원형질를 생성 세포 (F)를 방지ROM이 전사 응답을 장착. 이 autofluorescence의 중요한 수준이 많이 죽었 죽어 protoplasts에 상승을주는의 결과가 않습니다. 이 방법으로 준비 protoplasts을 정렬 할 때이 정렬에 사용되는 580 nm의 대 530 나노 미터 형광 그래프의 여러 별개의 인구를 참조하는 것이 매우 일반적입니다. 함께이 프로토콜에서 사용되는 정렬 게이트와 함께의 예는 그림 3에 표시됩니다. Protoplasts는 솔루션의 8 권으로 정렬하여 농축을 확인하는 시각화를 위해 수집. 그림 2G는 경비 세포에 GFP를 표현 TP382 줄을 사용하여이의 예를 보여줍니다 할 수 있습니다. 이전과 증폭 후 모두이 방법을 사용하여 얻을 수 수율의 예는 표 1에 표시됩니다. 얻은 금액은 박수 피코 WTA 시스템 (500 PG-50 NG), 따라서 S를 사용하여 증폭에 충분한qPCR에 의해 ubsequent 분석 (그림 4), 차세대 시퀀싱 또는 microarray. 그림 1. 실험 전체 워크 플로우. 1) 수확은 Arabidopsis 라인을 표현 GFP에서 관심을 출발합니다. 2) 신속하게 ~ 1mm 폭 스트립에 잘라 즉시 protoplasting 솔루션과 진공 침투에 다음을 전송할 수 있습니다. 3) 3-4 시간에 품다. 4) 70 μm의 체를 통해 조심스럽게 여과 원형질 솔루션, 원심 분리하여 아래쪽 튜브 및 펠릿의 protoplasts 반올림하기 위해 전송할 수 있습니다. 5) 바로 정렬하기 전에, 50 μm를 통해 resuspend protoplasts 및 정렬 튜브로 전송 필터입니다. 6) 정렬 GFP 긍정적 GFP 부정적인 가능한 protoplasts. 7) Protoplasts 지금은 어느 시각적 분석 또는 qPCR, 차세대 시퀀싱이나 microarray 등의 기술을 사용 할 수 있습니다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within 페이지 = "항상"> 그림 2. 본 연구에 사용 된 KC464, KC274 및 TP382 라인. adaxial 표피에 GFP 표현을 보여주는 KC464 잎 A) 가로 절을 참조하십시오. B) Protoplasts는 KC464 잎에서 파생. vasculature에 GFP 표현을 보여주는 KC274 잎 C) 가로 절을 참조하십시오. D KC274 잎에서 파생) Protoplasts. E) TP382 잎은 경비 세포에 GFP 식을 보여주고 있습니다. F) Protoplasts는 TP382 잎에서 파생. TP382 잎에서 파생 protoplasts의 높은 530/low 580 인구에서 protoplasts을 포함 GFP를 보여주는 잎 세포의 복잡한 배경에서 가드 셀을 표현 GFP의 FACS하여 얻은 농축의 G) 예. AF : 공 촛점 현미경 이미지, G : 형광 현미경 이미지입니다. 이미지 내의 스케일 바는 50 μm이다. 그림 3. 30분의 580 나노 미터 (오렌지) 대 40분의 530 나노 미터 (녹색) 대역 통과 필터 (BD의 유입 셀 정렬)에서 출력의 일반 FACS 수집 도트 플롯. 표시된 정렬 문은 일반적으로 정렬하는 동안 사용되는 수 있습니다. 하나의 낮은 530/low 580 인구를 보여주는 억제제의 부재에 protoplasted 콜-4 잎 유래 protoplasts,의 A) 점 플롯. 때문에 에페드린에 의한 스트레스와 색채에 580 형광의 변화를 보여주는 억제제의 존재에 protoplasted 중량 콜-4 잎 유래 protoplasts,에서 B) 점 플롯. 높은 530/low 580 인구의 인구를 포함하는 GFP를 보여주는 억제제의 존재에 protoplasted 각각 KC74, KC464 및 TP382 라인,,,의 잎 파생 protoplasts에서 CE) 다트 플롯. GFP (높은 530/low 580) 인구의 이벤트의 비율이 주어집니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . e_content "강한 : 유지 – together.within 페이지 ="항상 "> 그림 4. 그림 3과 같이 대표 출입을 금지 인구 분수에서 GFP를 표현. 복제 두 생물 그 다음 수행 된 GFP 특정 프리 머 (표 2)를 사용하여 박수 피코 WTA 시스템 및 qPCR을 사용하여 증폭, 각 분획 유형에 취득했다. 표시 값은 최고 (빨간색), 낮은 (녹색) 및 평균 상대 값입니다. 높은 580 인구가 두 분할이 경우에 있었고, 낮은 530/low 580과 하나의 생물 복제 만이 하나의 값이 표시 될 수 있도록 사용 된 높은 530/low 580. ACT2 (At3g18780)는 모든 샘플에 대한 표준으로 사용되었다. 잎 : 전체 잎. 정렬되지 않은 : 정렬되지 않은 protoplasts. GFP1 : 높은 530/low 580과 Rest1 : 낮은 530/low 580, GFP2 : 높은 530/high 580과 Rest2 : 그림 3과 삽입에 설명 된 낮은 530/high 580. 결과는 확인 O 아르정렬 분수 (예 : 그림 2G)에 GFP 셀 내용의 F 광학 평가는. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 견본 잎의 번호 셀의 번호 수율 RNA (NG) 수율 RNA (증폭, NG) 전체 잎 전체 잎 B 1 1 – – 8001 10,525 4623 *** 4572 *** 정렬되지 않은 protoplasts 정렬되지 않은 protoplasts의 B 5 5 – – 2433 2625 1152 *** 3321 *** GFP1 Rest1 15 6039 (0.39 % *) 55,389 (6.40% *) – ** – ** 861 489 GFP1 B Rest1 B 15 10,783 (0.63 % *) 57,040 (7.49 % *) – ** – ** 537 420 GFP2 Rest2 15 18,337 (1.49 % *) 62,405 (73.49 % *) – ** – ** 360 411 표 1. 샘플 FACS를 사용하여 수집 및 라이브 GFP-표현 protoplasts를 포함하는 분획 결정하는 qPCR으로 분석했다. 또한 박수 피코 WTA 시스템 (NuGen)와 증폭 전후 NG의 총 RNA 수율은이 표에 포함되어 있습니다. GFP1, GFP2, Rest1 및 Rest2 분수가 그림 4의 삽입에 표시됩니다. 전체 셀 정렬 실행의 세포의 *의 비율은 분수에있는 셀의 수를 옆에 괄호에 있습니다. 이 비율은에 상관하지 않습니다FACS 정렬은 '휴식'분수에 대한 실행 각 샘플에 대한 각 다른 하나는 이전 수집 화장실 세포의 훨씬 더 많기 때문에 GFP의 분수에 비해 중지되었습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 증폭 반응에 대한 입력으로 사용 ** 50 NG. 뇌관 순서 mGFP5 – ER.fw GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA mGFP5 – ER.rv TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT ACT2.fw GCCATCCAAGCTGTTCTCTC ACT2.rv GCCATCCAAGCTGTTCTCTC 표 2. qPCR의 프리 머.