Дифференцируя функциональной роли экспрессии генов от иммунной и не-иммунных клеток в мышь колит трансплантацией костного мозга
Summary
Трансплантация костного мозга дает возможность изменить генотип костного мозга клетки. Если ген интерес выражается как в костном мозге клеток, полученных и не полученных костного мозга клеток, трансплантация костного мозга может изменить костного мозга клеток разного генотипа без изменения без костного мозга клетки генотипа.
Abstract
Чтобы понять роль генов в развитии колита, мы сравнили ответы мышей дикого типа и ген интересов, дефицитных мышей нокаутом колит. Если ген интересов, выражается и в костном мозге клеток, полученных и не полученных костного мозга клеток хозяина, однако можно дифференцировать роль интересующего гена в костном мозге клеток, полученных и не костного мозга клеток, полученных из костного технику трансплантации костного мозга. Для изменения костного мозга клетки генотипа мышей, оригинальный костный мозг получателя мышей были уничтожены путем облучения, а затем заменяются новыми костного мозга донора различных генотипов. Когда мышей дикого типа донора костного мозга пересаживают на мышах, мы могли бы генерировать нокаутных мышей дикого типа экспрессия генов в клетках костного мозга, полученных клеток. Кроме того, при нокаутных мышей-доноров костного мозга пересаживают в дикий тип получателя мышей, мышей дикого типа без гена интересов, выражающийиз костного мозга клеток, полученных были произведены. Тем не менее, пересадка костного мозга не может быть на 100%. Таким образом, мы использовали кластер дифференцировки (CD) молекул (CD45.1 и CD45.2) в качестве маркеров донора и реципиента клетки для отслеживания доли донорского костного мозга клеток, полученных в получатель мышей и успех трансплантации костного мозга. Дикого типа мышей с генотипом и CD45.1 нокаутных мышей с генотипом CD45.2 были использованы. После облучения получателя мышей, доноров клеток костного мозга различных генотипов вводили в получатель мышей. Когда новый костный мозг регенерировать взять на свой иммунитет, мышей заражали химического агента (декстран сульфат натрия, DSS 5%), чтобы вызвать колит. Здесь мы также показали способ, чтобы побудить колита у мышей и оценить роль генов интерес, проявленный из костного мозга, полученных клеток. Если ген интересов, от клеток, полученных из костного играет важную роль в развитии заболевания (такие как кишечнаяТИС), фенотип получателя мышей с трансплантацией костного мозга может быть существенно изменен. В конце колит экспериментов, костного мозга клеток в крови и костном мозге были помечены антитела против CD45.1 и CD45.2 и их количественное соотношение существование может быть использован для оценки успеха пересадки костного мозга методом проточной цитометрии. Успешная трансплантация костного мозга должны показать подавляющее большинство генотипа (в срок маркер молекулу CD) над получателем генотипа как в костном мозге и крови мышей получателя.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это трансплантации костного мозга подход годится для иммунологии исследования колит, инфекции, рак, ожирение и другие заболевания. Это трансплантации костного мозга эксперимента необходима, когда ген интересов, выражается в обоих костного мозга и не костного мозга и клеток, полученны…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась пилота и гранты технико-экономическое обоснование с UCLA-CURE центр, Крона и колит фонда Америки развития карьеры Award (# 2691) и Национального института здоровья NIDDK K01 (DK084256) финансирование Hon Вай Кун.
Костный мозг облучения операция была оказана помощь Бернард Левин и Скотт Кухня UCLA Центра исследований СПИДа мыши / человека Химера объекта Core. Операции проточной цитометрии помогал UCLA объекта основных вектора.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) |
| Vaccutainer | BD | #8000813 |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II |
| Flow cytometer test tube | Falcon | #352052 |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
