Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti
Summary
Mikroglia merkezi sinir sisteminin savunma ve bağışıklık gözetim ilk satırı sağlamak makrofajlar ikamet ediyorsanız. MicroRNA aktivasyonu ve makrofaj farklılaşma da dahil olmak üzere bir çok fizyolojik süreçlerin önemli bir rol oynar düzenleyici moleküllerdir. Bu yazıda, mikroglia yılında microRNA ölçümü için bir yöntem sunduk.
Abstract
Mikroglia merkezi sinir sistemi (MSS) 1 ikamet miyeloid soyunun hücrelerdir. Bu hücreler multipl skleroz (MS) 2 gibi nöro-inflamasyonu ile ilişkili birçok hastalık patolojileri önemli bir rol oynamaktadır. Normal bir MSS mikroglia makrofaj belirteç CD11b ifade ve böyle CD45 olarak aktivasyonu düşük seviyelerde ifade ederek dinlenme fenotip sergilerler. MSS patolojik olaylar sırasında, mikroglia CD45 upregülasyonunun ve diğer belirteçler 3 olarak belirlenmiştir aktive olur. Mikroglia fenotip ve MSS işlevlerini etkileyen faktörler iyi çalışılmıştır değildir. MicroRNA (miRNA'lar) gibi hücre büyümesi ve farklılaşması 4 ve inflamasyon 5 gibi patolojiler gibi birçok normal fizyolojik süreç olarak katılıyor korunmuş molekülleri (~ 22 nükleotid uzunluğunda) büyüyen bir aileyiz. MiRNA'lar bağlayıcı tamamlayıcı dizileri tarafından belli bir hedef genlerin ifade downregulateir mRNA'ların ve makrofajlar 6 ve mikroglia 7 de dahil olmak üzere doğal bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu önemli bir rol oynamaktadır. Mikroglial fenotipi, biyolojik işlevini tanımlamak ve makrofajların diğer türlerinden mikroglia ayırmak için miRNA aracılı yollarının araştırılması amacıyla, kantitatif MSS yerleşik mikroglia farklı alt grupları özellikle microRNA ifade değerlendirmek için önemlidir. MSS kullarak ölçmek için ortak yöntemler tüm nöronal doku ve in situ hibridizasyon kantitatif PCR içerir. Ancak, bütün doku homojenattan kantitatif PCR nöronal doku hücrelerinin sadece% 5-15 temsil mikroglia miRNA ifadesi değerlendirilmesi, izin vermez. In situ hibridizasyon doku bölümlerini özel hücre tipleri içinde mikroRNA ile ifade değerlendirmesi sağlar, fakat bu yöntem tamamen niceliksel değildir. Bu yazıda, niceliksel ve sens tarifNormal MSS veya deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE), MS için fare modeli kullanılarak nöro-inflamasyonu sırasında izole mikroglia gerçek zamanlı PCR ile miRNA tespiti için itive yöntemi. Açıklanan yöntem, normal MSS veya MS, inme, travmatik yaralanma, Alzheimer hastalığı ve beyin tümörleri gibi çeşitli patolojiler ile ilişkili nöro-inflamasyonu sırasında mikroglia içinde microRNA ifade düzeyini ölçmek için yararlı olacaktır.
Protocol
Discussion
Yakın zamanda önemli bir ilgiyi mikroglia ve Nöro ve nörodejenerasyonunun ile ilişkilendirilen birçok patolojilerin bu hücrelerin infiltrasyonu verildi. Ayrıca, bağışıklık ve kanser hücrelerinin farklılaşmasında microRNA rolü önemli ölçüde son birkaç yıl 5,10 içinde büyüdü. Biz önceden normal MSS 7 mikroglia aktive olmayan veya dinlenme fenotip bakım miR-124 rolünü bildirdin, ama mikroglia fenotip ve aktivasyon devlet microRNA diğer türleri rolü keşfedilmeyi bekl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma NIH R01 NS071039-01A1 araştırma bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1X PBS | GIBCO | 14190 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| 10X PBS | Thermo Scientific | SH30258.02 | Can be prepared from dry components in the laboratory, pH: 7.2-7.4 |
| DMEM; FBS | GBCO | 11965; 10438 | |
| miRVana kit | Invitrogen | AM1561 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500 ml | 100 ml of 100% Percoll is prepared by mixing 10 ml of 10X PBS and 90 ml of Percoll from Sigma.
50 ml of 70% Percoll is prepared by mixing of 35 ml of 100% Percoll and 15 ml of DMEM 50 ml of 40% Percoll is prepared by mixing 20 ml of 100% Percoll and 30 ml of 1X PBS |
| MOG35-55 peptide | AnaSpec Inc | 60130-5 | |
| CFA | DIFCO | 263810 | |
| Pertussis Toxin | Sigma | P7208 | |
| FcR blocking antibodies | BD Biosciences | 553142 | Clone 2.4G2 |
| Anti-CD11b–PE mAb | BD Biosciences | 553311 | Can be used with different fluorophores (e.g. AF488) |
| Anti-CD45-APC-Cy7 mABs | Biolegend | 103116 | Can be used with different fluorophores (e.g. APC) |
| Paraformaldehyde (16%) | EMS Inc | 15710 | Dilute 1:15 in 1X PBS |
| 15% TBE-Urea Gel | Life Technologies Inc. | EC68855BOX | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies Inc | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies Inc | 4304437 | |
| TaqMan MicroRNA Assays mmu-miR-124a | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001182 | |
| TaqMan MicroRNA Assays snoRNA-55 | Life Technologies Inc | 4427975 ID 001228 | |
| Nuclease-free water | Life Technologies Inc | AM9937 | Nuclease-free water |
| 384-well clear optical reaction plate | Life Technologies Inc. | 4309849 | Can be substituted with other plates (e.g. 96 well plate) in different real-time PCR instruments |
| Dounce homogenizer (15 ml) | Wheaton Science Products. | 358044 | Teflon/glass |
| 40 μ nylon cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Big centrifuge | Sorval | RT 6000B | Rotor diameter 18.5 cm |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415 R | Rotor diameter 6.5 cm |
| Real-time PCR Instrument | Life Technologies Inc. | AB 7900 HT | Can be substituted with other instruments |
| Flow cytometer | BD Biosciencess | LSR II | Can be substituted with other instruments |
| FACS | BD Biosciences | FACSAria | Can be substituted with other instruments |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Tremblay, M. E. The Role of Microglia in the Healthy Brain. J. Neurosci. 31, 16064-16069 (2011).
- Graeber, M. B., Li, W., Rodriguez, M. L. Role of microglia in CNS inflammation. FEBS Lett. , (2011).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Perruisseau-Carrier, C., Jurga, M., Forraz, N., McGuckin, C. P. miRNAs stem cell reprogramming for neuronal induction and differentiation. Mol. Neurobiol. 43, 215-227 (2011).
- McCoy, C. E. The role of miRNAs in cytokine signaling. Front Biosci. 17, 2161-2171 (2010).
- He, M., Xu, Z., Ding, T., Kuang, D. M., Zheng, L. MicroRNA-155 regulates inflammatory cytokine production in tumor-associated macrophages via targeting C/EBPbeta. Cell Mol. Immunol. 6, 343-352 (2009).
- Ponomarev, E. D., Veremeyko, T., Barteneva, N., Krichevsky, A. M., Weiner, H. L. MicroRNA-124 promotes microglia quiescence and suppresses EAE by deactivating macrophages via the C/EBP-alpha-PU.1 pathway. Nat. Med. 17, 64-70 (2011).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546-3791 (2010).
- Gabriely, G. MicroRNA 21 promotes glioma invasion by targeting matrix metalloproteinase regulators. Mol. Cell Biol. 28, 5369-5380 (2008).
- Caffarelli, E., Filetici, P. Epigenetic regulation in cancer development. Front Biosci. 17, 2682-2694 (2011).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Gordon, R. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J. Neurosci. Methods. 194, 287-296 (2011).
- Moltzahn, F., Hunkapiller, N., Mir, A. A., Imbar, T., Blelloch, R. High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs. J. Vis. Exp. (54), e2552 (2011).
