Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri quantifies<em> C. elegans</em>, Sinaps yüzlerce hızla z-düzlemi projeksiyon tarafından tanıtılan bozulmaları olmadan tek bir örnek içinde karakterize izin vererek.
Synapse gücü presinaptik nörotransmitter serbest olaylara postsinaptik yanıtların genlik ifade eder, ve genel nöral devre fonksiyonu üzerinde büyük etkisi vardır. Synapse gücü kritik postsinaptik membran üzerinde sinaptik da kümelenmiş ve nörotransmitter reseptörlerinin bolluk bağlıdır. Reseptör düzeyleri gelişimsel olarak kurulan ve sinaptik plastisite ve nöromodülasyon önemli mekanizmalarını temsil eden yüzey lokalize, subsynaptic ve hücre içi havuzları arasında reseptör kaçakçılığı tarafından değiştirilebilir. Synaptically-lokalize nörotransmitter reseptör bolluk ölçmek için titiz bir yöntem geliştirme ve sinaptik plastisite çalışmak esastır. Olmayan-sinaptik havuzlarından sinaptik ayırt ve sinaps farklı lokalize reseptör popülasyonlar arasında ayrım, mekansal bilgi korur, çünkü floresan mikroskobu optimum bir yaklaşımdır. Genetik model organizma Caenorhabditis Eleganlar, özellikle de sağlıklı hayvan yerli sinapsların muayene izin, küçük boyutu ve göreceli kendi sinir sisteminin basitliği, şeffaflığı, ve güçlü genetik tekniklerin durumu nedeniyle bu çalışmalar için uygundur.
Burada C. floresan etiketli sinaptik nörotransmitter reseptörleri hesaplamak için bir yöntem sunmak elegans. Onun temel özelliği çoklu düzlem konfokal mikroskop çıktı dosyaları, tablolama konumu, hacmi, floresan ve her sinaps için toplam floresan üç boyutlu bireysel sinapsların otomatik tanımlama ve analiz olduğunu. Bu yaklaşım konfokal veri z-düzlemi projeksiyonlar manuel analizi üzerinde iki temel avantajı vardır. Konfokal veri seti her düzlemde yer alması nedeniyle Birincisi, hiçbir veri genellikle piksel yoğunluğu ortalamaları ya da maxima dayalı, z-düzlemi projeksiyon yoluyla kaybolur. Sinapsların İkincisi, otomatik tanımlama, ama ex kontrol edilebilirsinaps, çok sayıda veri doğru ve hızlı ekstraksiyon izin veri analizi ilerledikçe perimenter,. Örnek başına sinaps binlerce yüzlerce kolayca büyük veri üreten istatistiksel gücü maksimize etmek için ayarlar, elde edilebilir. C. hazırlarken dikkat edilmesi gereken noktalar analiz ve tedavi grupları içinde hayvanlar arasındaki değişkenliği en aza indirmek için konfokal görüntüleme gerçekleştirmek için elegans da tartışılır. C. analiz etmek için geliştirilmiş olsa da elegans postsinaptik reseptörler, bu yöntem gerçekten synaptically-lokalize protein, ya, ayrık kümeler, punktumlarda veya organeller yerleştiğini herhangi bir floresans sinyalinin herhangi bir türü için genellikle yararlıdır.
Prosedür üç aşamada gerçekleştirilir: 1) örnekleri, 2 hazırlanması) konfokal görüntüleme, ve 3) görüntü analizi. Basamak 1 ve 2 C. özgü elegans, 3. adımı genellikle odaklı mikrograflar herhangi punktat floresan sinyal için geçerli iken.
Burada sunulan yöntemi C. sinapsların büyük popülasyonlar için kantitatif çok parametre veri ayıklamak için tasarlanmıştır elegans, tedavi grupları içindeki tutarlılığı en üst düzeye çıkarırken. Üç özellikleri bu hedeflere katkıda. İlk olarak, immun tüm hayvanlar aynı yaşta olması için senkron solucan nüfus yapılmaktadır. Ifade seviyelerinin gelişim düzenlemesi deneysel tedavinin etkisi gizleyen bu adım kritiktir (örn. UNC-49 GABA reseptörü immünfloresans içi…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar protokolünün gelişimi ile yardımcı A. Benham teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma BAB NIH hibe NS06747 tarafından finanse edildi
Name of the software | Company | Comments (optional) | |||||||
Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
Table 1. Solutions. |