Summary

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em> C. elegans</em

Published: August 10, 2012
doi:

Summary

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri quantifies<em> C. elegans</em>, Sinaps yüzlerce hızla z-düzlemi projeksiyon tarafından tanıtılan bozulmaları olmadan tek bir örnek içinde karakterize izin vererek.

Abstract

Synapse gücü presinaptik nörotransmitter serbest olaylara postsinaptik yanıtların genlik ifade eder, ve genel nöral devre fonksiyonu üzerinde büyük etkisi vardır. Synapse gücü kritik postsinaptik membran üzerinde sinaptik da kümelenmiş ve nörotransmitter reseptörlerinin bolluk bağlıdır. Reseptör düzeyleri gelişimsel olarak kurulan ve sinaptik plastisite ve nöromodülasyon önemli mekanizmalarını temsil eden yüzey lokalize, subsynaptic ve hücre içi havuzları arasında reseptör kaçakçılığı tarafından değiştirilebilir. Synaptically-lokalize nörotransmitter reseptör bolluk ölçmek için titiz bir yöntem geliştirme ve sinaptik plastisite çalışmak esastır. Olmayan-sinaptik havuzlarından sinaptik ayırt ve sinaps farklı lokalize reseptör popülasyonlar arasında ayrım, mekansal bilgi korur, çünkü floresan mikroskobu optimum bir yaklaşımdır. Genetik model organizma Caenorhabditis Eleganlar, özellikle de sağlıklı hayvan yerli sinapsların muayene izin, küçük boyutu ve göreceli kendi sinir sisteminin basitliği, şeffaflığı, ve güçlü genetik tekniklerin durumu nedeniyle bu çalışmalar için uygundur.

Burada C. floresan etiketli sinaptik nörotransmitter reseptörleri hesaplamak için bir yöntem sunmak elegans. Onun temel özelliği çoklu düzlem konfokal mikroskop çıktı dosyaları, tablolama konumu, hacmi, floresan ve her sinaps için toplam floresan üç boyutlu bireysel sinapsların otomatik tanımlama ve analiz olduğunu. Bu yaklaşım konfokal veri z-düzlemi projeksiyonlar manuel analizi üzerinde iki temel avantajı vardır. Konfokal veri seti her düzlemde yer alması nedeniyle Birincisi, hiçbir veri genellikle piksel yoğunluğu ortalamaları ya da maxima dayalı, z-düzlemi projeksiyon yoluyla kaybolur. Sinapsların İkincisi, otomatik tanımlama, ama ex kontrol edilebilirsinaps, çok sayıda veri doğru ve hızlı ekstraksiyon izin veri analizi ilerledikçe perimenter,. Örnek başına sinaps binlerce yüzlerce kolayca büyük veri üreten istatistiksel gücü maksimize etmek için ayarlar, elde edilebilir. C. hazırlarken dikkat edilmesi gereken noktalar analiz ve tedavi grupları içinde hayvanlar arasındaki değişkenliği en aza indirmek için konfokal görüntüleme gerçekleştirmek için elegans da tartışılır. C. analiz etmek için geliştirilmiş olsa da elegans postsinaptik reseptörler, bu yöntem gerçekten synaptically-lokalize protein, ya, ayrık kümeler, punktumlarda veya organeller yerleştiğini herhangi bir floresans sinyalinin herhangi bir türü için genellikle yararlıdır.

Prosedür üç aşamada gerçekleştirilir: 1) örnekleri, 2 hazırlanması) konfokal görüntüleme, ve 3) görüntü analizi. Basamak 1 ve 2 C. özgü elegans, 3. adımı genellikle odaklı mikrograflar herhangi punktat floresan sinyal için geçerli iken.

Protocol

1. Görüntüleme için Worms hazırlanması Bu protokolün segmenti yayınlanan C. dayanmaktadır elegans kültür teknikleri 1,2 ve Şekil 1'de belirtilmiştir. NA22 E. ile yüksek pepton NGM agar (10 cm) numaralı seribaşı üzerine solucanlar büyür coli bakterisinin neredeyse açlıktan kadar. Immun Eğer, bir tabak güvenilir yol boyunca hesap kayıpları dikkate alındığında, ve görüntüleme için wo…

Discussion

Burada sunulan yöntemi C. sinapsların büyük popülasyonlar için kantitatif çok parametre veri ayıklamak için tasarlanmıştır elegans, tedavi grupları içindeki tutarlılığı en üst düzeye çıkarırken. Üç özellikleri bu hedeflere katkıda. İlk olarak, immun tüm hayvanlar aynı yaşta olması için senkron solucan nüfus yapılmaktadır. Ifade seviyelerinin gelişim düzenlemesi deneysel tedavinin etkisi gizleyen bu adım kritiktir (örn. UNC-49 GABA reseptörü immünfloresans içi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar protokolünün gelişimi ile yardımcı A. Benham teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma BAB NIH hibe NS06747 tarafından finanse edildi

Materials

Name of the software Company   Comments (optional)
Volocity v4.0 or higher PerkinElmer/Improvision   Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity.
      Table 2. Specific reagents and equipment.
     
Egg buffer NaCl
KCl
CaCl2
MgCl2
HEPES
(Adjust pH to 7.3)
118 mM
48 mM
2 mM
2 mM
24 mM
Alkaline hypochlorite (for 5 ml) Fresh household bleach (discard bottle 30 days after opening)
10 N NaOH
ddH2O
1.0 ml 0.25 ml
3.75 ml

 

      Table 1. Solutions.

References

  1. Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
  3. Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
  4. Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
  5. Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
  6. Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
  7. Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
  8. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  9. Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
  10. Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  11. McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
  12. Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).

Play Video

Cite This Article
Sturt, B. L., Bamber, B. A. Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans. J. Vis. Exp. (66), e4090, doi:10.3791/4090 (2012).

View Video