Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em> C. elegans</em
Summary
A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução em<em> C. elegans</em>, Permitindo que centenas de sinapses para ser rapidamente caracterizados dentro de uma única amostra, sem distorções introduzidas pela z-plano de projecção.
Abstract
Força Synapse refere-se à amplitude das respostas pós-sinápticos para eventos de liberação de neurotransmissores pré-sinápticos, e tem um grande impacto na função circuito neural global. Synapse força crítica depende da abundância de receptores de neurotransmissores agrupadas em sítios sinápticos na membrana pós-sináptica. Níveis de receptores são estabelecidos developmentally, e pode ser alterada por tráfico entre pools receptor de superfície localizada, subsináptica, e intracelular, que representam importantes mecanismos de plasticidade sináptica e neuromodulação. Métodos rigorosos para quantificar sinapticamente localizada abundância receptor neurotransmissor são essenciais para estudar o desenvolvimento e plasticidade sináptica. A microscopia de fluorescência é uma abordagem ideal porque preserva informação espacial, distinguindo sináptica de não-sinápticos piscinas e discriminar entre as populações de receptores localizados em diferentes tipos de sinapses. A genética organismo modelo Caenorhabditis elegans é particularmente bem adequado para estes estudos, devido ao pequeno tamanho e simplicidade relativa do seu sistema nervoso, a sua transparência, e da disponibilidade de poderosas técnicas genéticas, permitindo o exame das sinapses nativas em animais intactos.
Aqui apresentamos um método de quantificação fluorescente-etiquetados receptores de neurotransmissores sinápticos em C. elegans. Sua característica fundamental é a identificação automatizada e análise individual das sinapses em três dimensões no plano multi-arquivos microscópio confocal de saída, a posição de tabulação, volume, intensidade de fluorescência, fluorescência e total para cada sinapse. Esta abordagem tem duas vantagens principais sobre a análise manual de z-plano projeções de dados confocal. Primeiro, porque todos os planos do conjunto de dados confocal está incluído, não existem dados são perdidos devido a z-plano de projeção, normalmente com base nas médias de intensidade de pixel ou maxima. Identificação, segundo as sinapses é automatizado, mas pode ser inspecionado pelo experimenter como o produto de análise de dados, permitindo a extração rápida e precisa dos dados de um grande número de sinapses. Centenas de milhares de sinapses por amostra pode ser facilmente obtida, produzindo grandes conjuntos de dados para maximizar a potência estatística. Considerações para a preparação de C. elegans para análise, e realizando imagem confocal para minimizar a variabilidade entre os animais nos grupos de tratamento são também discutidos. Embora tenha sido desenvolvido para analisar C. receptores pós-sinápticos elegans, este método é geralmente útil para qualquer tipo de sinapticamente localizada proteína, ou, na verdade, qualquer sinal de fluorescência que está localizada a aglomerados discretas, puncta, ou organelos.
O procedimento é realizado em três passos: 1) preparação de amostras, 2) imagem confocal, e 3) análise de imagem. Passos 1 e 2 são específicos para C. elegans, enquanto o passo 3 é geralmente aplicável a qualquer sinal de fluorescência em ponteada micrografias confocal.
Protocol
Discussion
O método aqui apresentado é projetado para extrair quantitativos múltiplos parâmetros de dados para grandes populações de sinapses em C. elegans, enquanto maximiza a consistência dentro de grupos de tratamento. Três características contribuir para estes objectivos. Em primeiro lugar, imunocoloração é realizada em populações de vermes síncronas para assegurar que todos os animais são da mesma idade. Este passo é crítico porque regulação do desenvolvimento de níveis de expressão podem obscur…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer A. Benham para ajudar com o desenvolvimento do protocolo. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão NS06747 para BAB
Materials
| Name of the software | Company | Comments (optional) | |||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
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| Table 1. Solutions. |
References
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