כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em> ג elegans</em
Summary
שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה ב<em> ג elegans</em>, המאפשר מאות סינפסות להתאפיין במהירות ללא עיוותים הציג תחזית Z-המטוס בתוך מדגם אחד.
Abstract
עוצמת הסינפסה מתייחס משרעת של תגובות postsynaptic לאירועים presynaptic שחרור הנוירוטרנסמיטר, ויש לו השפעה משמעותית על התפקוד הכללי במעגל העצבי. עוצמת הסינפסה תלויה באופן קריטי שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות באתרים הסינפטיים על קרום postsynaptic. רמות הקולטן מבוססים מבחינה התפתחותית, והוא יכול להשתנות על ידי הקולטן סחר בין בריכות קרקע מקומי, subsynaptic, ו תאיים, המייצגים מנגנונים חשובים של פלסטיות סינפטית neuromodulation ו. שיטות מחמירות לכמת synaptically-מקומי הקולטן שפע הנוירוטרנסמיטר חיוניים ללמוד פיתוח הפלסטיות הסינפטית ו. מיקרוסקופ פלואורסצנטי היא גישה אופטימלית, כי היא שומרת מידע מרחבי, להבדיל מ – סינפטי לא סינפטיים בריכות, ומפלה בין אוכלוסיות מקומיות הקולטן לסוגים שונים של סינפסות. אורגניזם גנטי מודל Caenorhabditis eleganזה מתאים במיוחד עבור אלה מחקרים בשל גודל קטן הפשטות היחסית של מערכת העצבים שלו, השקיפות שלו, ואת הזמינות של טכניקות גנטיות רבות עוצמה, ומאפשר בחינה של סינפסות דובר בבעלי חיים שלמים.
כאן אנו מציגים שיטה לכימות fluorescently שכותרתו קולטני הנוירוטרנסמיטר סינפטיים ב C. elegans. תכונת המפתח שלה הוא זיהוי וניתוח אוטומטי של סינפסות בודדות בשלושה ממדים רב המטוס confocal פלט קבצים מיקרוסקופ, מיקום tabulating, נפח, עוצמת הקרינה, וכן הקרינה הכוללת של כל סינפסה. גישה זו יש שני יתרונות עיקריים על פני ניתוח ידני של Z-המטוס תחזיות של נתונים confocal. ראשית, כי כל מטוס של סט נתונים confocal כלול, הנתונים לא הולכים לאיבוד דרך הקרנת Z-המטוס, המבוססת בדרך כלל על ממוצעים בעוצמה פיקסל או מקסימה. הזיהוי השני, של סינפסות היא אוטומטית, אבל יכול להיבדק על ידי לשעברperimenter עם התקדמות ניתוח נתונים, המאפשר מיצוי מהיר ומדויק של נתונים מתוך מספר רב של סינפסות. מאות עד אלפי סינפסות לפי המדגם יכול בקלות לקבל, ייצור ערכות נתונים גדולות, על מנת למקסם את כוח סטטיסטי. שיקולים להכנת ג elegans לניתוח, ולבצע הדמיה confocal כדי למזער את השונות בין בעלי חיים בתוך קבוצות הטיפול הם דנו גם. למרות שפותחה לנתח ג קולטנים elegans postsynaptic, שיטה זו היא בדרך כלל שימושית עבור כל סוג של חלבון synaptically, מקומית, או למעשה, כל אות הקרינה, כי הוא מקומי לאשכולות נפרדים, puncta או האברונים.
ההליך מתבצע בשלושה שלבים: 1) הכנת דוגמאות, 2) הדמיה confocal, ו 3) ניתוח התמונה. שלבים 1 ו -2 הן ספציפיות ג elegans, ואילו בשלב 3 הוא בדרך כלל החל על כל אות הקרינה punctate ב micrographs confocal.
Protocol
Discussion
השיטה המוצגת כאן נועדה לחלץ כמותיים רב פרמטרים הנתונים על אוכלוסיות גדולות של סינפסות ב C. elegans, תוך מיקסום עקביות בתוך קבוצות הטיפול. שלוש תכונות לתרום יעדים אלה. ראשית, immunostaining מבוצע על אוכלוסיות תולעת סינכרוני על מנת להבטיח כי כל בעלי החיים הם בני אותו גיל. שלב ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים א בנהם לסיוע בפיתוח של פרוטוקול. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענק NS06747 אל באב
Materials
| Name of the software | Company | Comments (optional) | |||||||
| Volocity v4.0 or higher | PerkinElmer/Improvision | Check your local imaging core facility for access to this software. Demo software is available at the PerkinElmer website. This method requires only the Quantitation module of Volocity. | |||||||
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||||||||
|
|||||||||
| Table 1. Solutions. |
References
- Christensen, M. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122, 2517-2527 (1996).
- Davis, K. M. Regulated lysosomal trafficking as a mechanism for regulating GABAA receptor abundance at synapses in Caenorhabditis elegans. Mol. Cell Neurosci. 44, 307-317 (2010).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Rowland, A. M. Presynaptic terminals independently regulate synaptic clustering and autophagy of GABAA receptors in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 26, 1711-1720 (2006).
- Burbea, M. Ubiquitin and AP180 regulate the abundance of GLR-1 glutamate receptors at postsynaptic elements in C. elegans. Neuron. 35, 107-120 (2002).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Oda, S., Tomioka, M., Iino, Y. Neuronal plasticity regulated by the insulin-like signaling pathway underlies salt chemotaxis learning in Caenorhabditis elegans. J. Neurophysiol. 106, 301-308 (2011).
- Sankaranarayanan, S. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
- McDonald, N. A. Generation and functional characterization of fluorescent, N-terminally tagged CB1 receptor chimeras for live-cell imaging. Mol. Cell Neurosci. 35, 237-248 (2007).
- Shakiryanova, D. Synaptic neuropeptide release induced by octopamine without Ca2+ entry into the nerve terminal. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4477-4481 (2011).
