Automatisierte Quantifizierung der Fluoreszenz-in Synaptic<em> C elegans</em

Synapse Stärke bezieht sich auf die Amplitude des postsynaptischen Antworten auf präsynaptische Freisetzung von Neurotransmittern Ereignisse, und hat einen großen Einfluss auf die Gesamt-neuronalen Schaltkreis-Funktion. Synapse Stärke hängt entscheidend von der Fülle von Neurotransmitter-Rezeptoren an Synapsen auf der postsynaptischen Membran gruppierten. Rezeptor-Ebenen sind entwicklungsgeschichtlich, etabliert und kann durch Rezeptortransport zwischen Oberflächen-lokalisierten, subsynaptischen und intrazellulären Pools, die für wichtige Mechanismen der synaptischen Plastizität und Neuromodulation verändert werden. Rigorosen Methoden zur synaptisch-lokalisierte Neurotransmitter-Rezeptor Fülle quantifizieren sind unerlässlich, um synaptischen Entwicklung und Plastizität zu studieren. Die Fluoreszenzmikroskopie ist optimal, weil es räumliche Information erhält, unterscheiden synaptischen aus nicht-synaptischen Pools und Unterscheiden zwischen Rezeptorpopulationen lokalisiert, um verschiedene Arten von Synapsen. Die genetischen Modellorganismus Caenorhabditis elegans ist besonders gut für diese Studien aufgrund der geringen Größe und der relativen Einfachheit seines Nervensystems, seine Transparenz, und die Verfügbarkeit von leistungsfähigen genetischen Techniken geeignet und ermöglicht Untersuchung der nativen Synapsen in intakten Tieren.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Quantifizierung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Neurotransmitter-Rezeptoren in C. elegans. Sein wesentliches Merkmal ist die automatisierte Identifikation und Analyse einzelner Synapsen in drei Dimensionen in mehreren Ebenen konfokalen Mikroskop Ausgabedateien, Tabellieren Position, Volumen, Intensität der Fluoreszenz, Fluoreszenz und insgesamt für jede Synapse. Dieser Ansatz hat zwei wesentliche Vorteile gegenüber der manuellen Analyse der z-Ebene konfokale Projektionen von Daten. Erstens, weil jede Ebene des konfokalen Datensatz enthalten ist, werden keine Daten über z-Ebene Projektion verloren, in der Regel auf Pixelintensität Durchschnitte oder Maxima basiert. Zweitens Identifizierung von Synapsen automatisiert ist, aber durch die ex überprüft werdenperimenter wie die Datenanalyse geht, so dass eine schnelle und genaue Extrahierung von Daten aus einer großen Anzahl von Synapsen. Hunderte bis Tausende von Synapsen pro Probe leicht erhalten werden, produzieren große Datensätze statistische Energie zu maximieren. Überlegungen zur Vorbereitung C. elegans zur Analyse und Durchführung konfokale Bildgebung an Variabilität zwischen den Tieren innerhalb Behandlungsgruppen zu minimieren werden ebenfalls diskutiert. Zwar entwickelt, um C zu analysieren elegans postsynaptischen Rezeptoren, ist dieses Verfahren im Allgemeinen für jede Art von synaptisch-lokalisierten Protein oder Tat, einem Fluoreszenz-Signal, das diskrete Cluster, Punkte oder Organellen lokalisiert ist nützlich.

Das Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt: 1) Herstellung von Proben, 2) konfokale Abbildung, und 3) Bildanalyse. Schritt 1 und 2 sind spezifisch für C elegans, und Stufe 3 ist allgemein anwendbar auf jede punktförmige Fluoreszenz-Signal in der konfokalen Aufnahmen.