Geautomatiseerde Kwantificering van synaptische Fluorescentie in<em> C. elegans</em

Synapse kracht verwijst naar de amplitude van postsynaptische reacties op presynaptische neurotransmitters evenementen, en heeft een grote invloed op de totale neurale circuit functie. Synapse kracht is afhankelijk kritisch over de overvloed aan neurotransmitter receptoren geclusterd op synaptische sites op het postsynaptische membraan. Receptor niveaus in hun ontwikkeling vastgesteld, en kan worden veranderd door receptor handel tussen oppervlakte-gelokaliseerde, subsynaptic, en intracellulaire zwembaden, die belangrijke mechanismen van synaptische plasticiteit en neuromodulatie. Strenge methoden om synaptisch-gelokaliseerde neurotransmitter-receptor overvloed te kwantificeren zijn essentieel voor synaptische ontwikkeling en plasticiteit te bestuderen. Fluorescentie microscopie is een optimale aanpak omdat het behoudt ruimtelijke informatie, waarbij onderscheid wordt synaptische van niet-synaptische zwembaden, en onderscheid te maken tussen de receptor populaties gelokaliseerd in verschillende types van synapsen. De genetische model organisme Caenorhabditis, elegants is bijzonder goed geschikt voor deze studies te wijten aan de geringe omvang en de relatieve eenvoud van het zenuwstelsel, de transparantie, en de beschikbaarheid van krachtige genetische technieken, waardoor het onderzoek van inheemse synapsen in intacte dieren.

Hier presenteren we een methode voor het kwantificeren van fluorescent gelabelde synaptische neurotransmitter receptoren in C. elegans. De belangrijkste functie is de automatische identificatie en analyse van individuele synapsen in drie dimensies in multi-plane confocale microscoop output-bestanden, rangschikken positie, volume, fluorescentie-intensiteit, en de totale fluorescentie voor elke synaps. Deze aanpak heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van handmatige analyse van de z-plane projecties van confocale gegevens. Ten eerste omdat elk gebied van de confocale dataset betrekking hebben, zijn geen gegevens verloren gaan door z-vlak projectie, meestal op basis van pixel intensiteit gemiddelden of maxima. Ten tweede, de identificatie van synapsen is geautomatiseerd, maar kan worden gecontroleerd door de experimenter als de data-analyse opbrengst, waardoor snelle en nauwkeurige extractie van gegevens uit een groot aantal synapsen. Honderden tot duizenden synapsen per monster kunnen gemakkelijk worden verkregen, het produceren van grote datasets te maximaliseren statistische power. Overwegingen voor het bereiden van C. elegans voor analyse, en het uitvoeren van confocale beelden van de variabiliteit tussen de dieren in de behandelingsgroepen een minimum te beperken worden ook besproken. Hoewel ontwikkeld C. analyseren elegans postsynaptische receptoren Deze methode is algemeen bruikbaar voor elk type synaptisch-gelokaliseerde eiwit of zelfs een fluorescentiesignaal die is gelokaliseerd op discrete clusters puncta of organellen.

De procedure wordt uitgevoerd in drie stappen: 1) de voorbereiding van de monsters, 2) confocale beeldvorming, en 3) beeldanalyse. Trappen 1 en 2 zijn aan C. elegans, terwijl stap 3 is over het algemeen van toepassing op alle punctata fluorescentie-signaal in de confocale microscopie.