Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio
Summary
Un método para cargar subventricular (SVZ de zona) células con colorantes indicadores de calcio para el registro de la actividad de calcio se describe. El postnatal SVZ contiene células apretadas, incluyendo las células progenitoras neurales y neuroblastos. En lugar de utilizar carga baño se inyecta el medio de contraste por la presión en el interior del tejido que permite una mejor difusión de tinte.
Abstract
La zona subventricular (SVZ) es una de las dos zonas neurogénica en el cerebro postnatal. El SVZ contiene células densamente empaquetados, incluyendo las células progenitoras neuronales con características astrocytic (llamadas astrocitos SVZ), neuroblastos y células progenitoras intermedios. Neuroblastos nacidos en la SVZ tangencialmente emigrar a una gran distancia hasta el bulbo olfatorio, donde se diferencian en interneuronas. La señalización intercelular a través de moléculas de adhesión y señales difusibles juegan papeles importantes en la neurogénesis de control. Muchas de estas señales de desencadenar la actividad del calcio intercelular que transmite la información dentro y entre las células. La actividad del calcio es por lo tanto un reflejo de la actividad de señales extracelulares y es una forma óptima de comprender la señalización intercelular entre las células funcionales SVZ.
Actividad calcio ha sido estudiado en muchas otras regiones y tipos de células, incluyendo los astrocitos y neuronas maduras. Sin embargo, el método tradicional para loacélulas D con tinte indicador de calcio (es decir, la carga baño) no fue eficaz en la carga de todos los tipos de células SVZ. En efecto, la densidad celular en la SVZ se opone a la difusión del colorante en el interior del tejido. Además, la preparación de cortes sagitales mejor preservará la disposición tridimensional de las células SVZ, en particular la secuencia de la migración de neuroblastos en el eje rostral caudal.
A continuación, se describen métodos para preparar las secciones sagitales que contienen la SVZ, la carga de las células SVZ con tinte indicador de calcio, y la adquisición de la actividad del calcio con películas de time-lapse. Se utilizó Fluo-4 a.m. colorante para la carga de los astrocitos SVZ utilizando la aplicación de presión en el interior del tejido. La actividad del calcio fue grabado usando un microscopio confocal de barrido que permite una resolución precisa para distinguir las células individuales. Nuestro enfoque es aplicable a otras zonas neurogénicas incluyendo el hipocampo adulto zona subgranular y embrionarias zonas neurogénicos. Además, otros tipos de tintes puedeaplicarse utilizando el método descrito.
Protocol
Discussion
Imágenes de calcio de células SVZ se ha utilizado para estudiar los patrones de actividad espontánea en neuroblastos 10, la expresión del receptor de canal en ambos neuroblastos y astrocitos 4,6,8 y ondas astrocíticos calcio 3. Dado que las células en la SVZ son o bien inmaduros o que tienen propiedades gliales, no se activan los potenciales de acción 11,12, lo que significa que los cambios en el potencial de voltaje de milisegundos indicativos de la actividad en las re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH (DC007681, AB), CT donación de células madre (AB), Pardee base (AB), Ruth L. Kirschstein Predoctoral Nacional del Servicio de Investigación Premios (NRSA) (Szy), y una investigación NSF Graduate Fellowship (BL). Agradecemos a los miembros del laboratorio Bordey por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito. El presente material está basado en trabajo apoyado en parte por el Estado de Connecticut bajo el Stem Cell Research Connecticut Programa de Subvenciones. Su contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial del Estado de Connecticut, el Departamento de Salud Pública del Estado de Connecticut CT o Innovations, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
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