Подготовка Острый субвентрикулярной фрагменты зона для кальция изображений
Summary
Метод для загрузки субвентрикулярной зону (СВЗ) клеток кальцием индикатор красители для записи активности кальция описано. Послеродовой SVZ содержит плотно упакованных клеток, включая нервные клетки предшественники и нейробластов. Вместо того чтобы использовать ванну загрузки мы вводили красителя давление внутри тканей позволяет лучше красителя диффузии.
Abstract
Субвентрикулярной зону (СВЗ) является одним из двух нейрогенных зон в постнатальном мозге. SVZ содержит плотно упакованных клеток, включая нервные клетки предшественники с астроцитов особенностей (так называемые SVZ астроциты), нейробластов и промежуточных клеток-предшественников. Нейробластов родился в SVZ касательной мигрировать на большие расстояния в обонятельную луковицу, где они дифференцируются в интернейронов. Межклеточной передачи сигналов через молекул адгезии и диффузии сигналы играют важную роль в борьбе с нейрогенеза. Многие из этих сигналов вызывают межклеточное деятельности кальция, который передает информацию внутри и между клетками. Кальций деятельности, таким образом, отражает активность внеклеточных сигналов и является оптимальным способом понять функциональное межклеточной сигнализации между клетками SVZ.
Кальций деятельность изучалась во многих других регионах и типах клеток, в том числе зрелые астроциты и нейроны. Тем не менее, традиционный метод, чтобы лоаг клеток кальцием индикатор красителя (например, ванны нагрузки) не был эффективным при загрузке всех типов SVZ клетки. Действительно, сотовая плотность в SVZ препятствует диффузии красителя в ткань. Кроме того, готовится сагиттальных будет лучше сохранить трехмерное расположение клеток СВЗ, в частности, поток миграции нейробластов на ростральной-каудальной оси.
Здесь мы опишем методы для подготовки сагиттальной разделов, содержащих SVZ, загрузка клетки SVZ с кальцием краситель индикатор, и приобретение кальция деятельность с покадровой фильмов. Мы использовали Fluo-4 утра краситель для загрузки SVZ астроциты с помощью давления приложения внутри ткани. Кальций деятельности был записан при помощи сканирующей конфокальной микроскопии позволяет точное разрешение для различения отдельных клеток. Наш подход применим и к другим нейрогенных зон, включая взрослого гиппокампа субгранулярной зоны и эмбриональных нейрогенных зон. Кроме того, другие виды красителей можетнаноситься с помощью описанного метода.
Protocol
Discussion
Кальций визуализации клеток SVZ была использована для изучения закономерностей в спонтанной активности в нейробластах 10, рецептор канала выражения в обоих нейробластов и астроциты 4,6,8 и астроцитов волны кальция 3. Так как клетки в SVZ либо незрелый или иметь глиальных с?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH (DC007681, AB), CT стволовых клеток гранта (AB), Парди основания (AB), Predoctoral Рут Л. Kirschstein Национальный исследовательский службы Awards (НРСА) (SZY) и NSF аспирантуре Стипендия (BL). Мы благодарим членов Bordey лаборатории за полезные замечания по рукописи. Настоящий материал основан на работе частично поддержана штата Коннектикут под сотовый Коннектикут стволовых Программа исследовательских грантов. Его содержание несут исключительно авторы и не обязательно отражают официальную точку зрения штата Коннектикут, Департамент здравоохранения штата Коннектикут или КТ инноваций, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
