Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l'imagerie calcique
Summary
Une méthode pour charger des sous-ventriculaire (SVZ zone) des cellules avec des colorants indicateurs de calcium pour l'activité de calcium enregistrement est décrit. Le postnatale SVZ contient des cellules serrées y compris les cellules progénitrices neurales et neuroblastes. Plutôt que d'utiliser le chargement de bain nous avons injecté le colorant par la pression à l'intérieur du tissu permettant une meilleure diffusion du colorant.
Abstract
La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l'une des deux zones neurogènes dans le cerveau postnatal. La SVZ contient des cellules très denses, y compris les cellules progénitrices neurales avec des caractéristiques astrocytaires (appelées astrocytes SVZ), neuroblastes, et les cellules progénitrices intermédiaires. Neuroblastes nés dans la SVZ tangentiellement migrer une grande distance vers le bulbe olfactif, où ils se différencient en interneurones. Signalisation intercellulaires par l'intermédiaire des molécules d'adhésion et de signaux diffusibles jouent un rôle important dans la neurogenèse contrôle. Beaucoup de ces signaux déclencher l'activité de calcium intracellulaire qui transmet l'information à l'intérieur et entre les cellules. L'activité de calcium est donc le reflet de l'activité des signaux extracellulaires et est un meilleur moyen de comprendre fonctionnelle signalisation intercellulaire entre les cellules SVZ.
L'activité de calcium a été étudiée dans de nombreuses autres régions et types de cellules, y compris les astrocytes et les neurones matures. Cependant, la méthode traditionnelle de loacellules d avec indicateur de calcium colorant (chargement de bain par exemple) n'était pas efficace pour le chargement de tous les types de cellules SVZ. En effet, la densité cellulaire dans la SVZ empêche la diffusion de colorant dans le tissu. En outre, la préparation de coupes sagittales sera mieux préserver l'agencement tridimensionnel de cellules, en particulier SVZ le flux de migration neuroblaste sur l'axe rostro-caudal.
Ici, nous décrivons les méthodes pour préparer des coupes sagittales contenant la SVZ, le chargement des cellules SVZ avec colorant indicateur de calcium, et de l'acquisition de l'activité de calcium avec time-lapse films. Nous avons utilisé Fluo-quatre heures colorant pour le chargement astrocytes SVZ l'aide de l'application de pression à l'intérieur du tissu. L'activité de calcium a été enregistrée à l'aide d'un microscope confocal à balayage permettant une résolution précise pour distinguer les cellules individuelles. Notre approche est applicable à d'autres zones neurogènes y compris la zone sous-granulaire de l'hippocampe et des adultes embryonnaires zones neurogènes. En outre, d'autres types de colorants peuventêtre appliqué en utilisant le procédé décrit.
Protocol
Discussion
Imagerie calcique des cellules SVZ a été utilisé pour étudier les tendances de l'activité spontanée dans les neuroblastes 10, l'expression du récepteur de canal dans les deux neuroblastes et les astrocytes et des vagues de calcium 4,6,8 astrocytaires 3. Comme les cellules de la SVZ sont soit immatures ou ayant des propriétés gliales, ils ne se déclenche pas d'action potentiels 11,12, ce qui signifie que les changements dans milliseconde potentiel de tensi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DC007681, AB), CT cellules souches subvention (AB), Pardee fondation (AB), Ruth L. prédoctorale Kirschstein national de recherches des bourses (NRSA) (SZY), et un NSF Graduate Research Fellowship (BL). Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Bordey des commentaires utiles sur le manuscrit. Le matériel actuel est basé sur le travail soutenu en partie par l'État du Connecticut Connecticut sous la tige subventions Cellulaire Programme de recherche. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l'État du Connecticut, le ministère de la Santé publique de l'État du Connecticut CT ou des innovations, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
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