التخصيص الرشاشيات النيجر علم الصرف عن طريق إضافة من الجسيمات الدقيقة التلك
Summary
وهناك طريقة لتوليد وعلى وجه التحديد لتوصيف شامل التشكل من الفطريات الخيطية<em> الرشاشيات النيجر</emيوصف>، والذي يسمح للعلاقة الرياضية للظهور المورفولوجية والإنتاجية.
Abstract
أ. الفطريات الخيطية النيجر هو سلالة تستخدم على نطاق واسع في مجموعة واسعة من العمليات الصناعية من المواد الغذائية إلى صناعة المستحضرات الصيدلانية. واحدة من الخصائص الأكثر إثارة للاهتمام، وغالبا ما لا يمكن السيطرة عليها من هذا الكائن الحي هو الخيطية مورفولوجيا المعقدة. وهي تتراوح بين كريات كروية كثيفة على فطر لزج (الشكل 1). ومن المعروف المعلمات عملية مختلفة ومكونات للتأثير على التشكل الفطرية 1. منذ الإنتاجية المثلى يرتبط بقوة مع شكل المورفولوجية محددة، ومورفولوجيا الفطرية غالبا ما يمثل عنق الزجاجة للإنتاجية في الإنتاج الصناعي.
وثمة نهج مستقيم إلى الأمام وأنيقة للسيطرة على وجه التحديد شكل الصرفي هو إضافة الجزيئات غير العضوية الصغيرة غير قابلة للذوبان (مثل سيليكات المغنيسيوم المائي، وأكسيد الألومنيوم أو أكسيد التيتانيوم السليكات) إلى الثقافة المتوسطة التي تسهم في انتاج الانزيم زادت 2-6. منذ وجود obv[إيووس] العلاقة بين مورفولوجيا الجسيمات الدقيقة تعتمد على إنتاج انزيم من المرغوب فيه لربط رياضيا الإنتاجية وظهور الصرفي. ولذلك يستهدف كمي وصف دقيق وشامل الصرفي.
وبالتالي، فإننا نقدم وسيلة لتوليد وتوصيف الجسيمات الصغيرة التي تعتمد هياكل شكلية، وإلى ربط مورفولوجيا الفطرية مع إنتاجية (الشكل 1) الذي يساهم ربما التوصل إلى فهم أفضل للmorphogenesis من الكائنات الحية الدقيقة الخيطية.
أ. سلالة المؤتلف يزرع النيجر SKAn1015 لمدة 72 ساعة في L 3 أثارت مفاعل حيوي للدبابات. بالإضافة إلى ذلك من قبل من الجسيمات الدقيقة التلك في تركيزات من 1 غرام / لتر، 3 غ / ل و 10 جرام / لتر قبل التلقيح يتم إنشاء بتكاثر مجموعة متنوعة من الهياكل الشكلية. وتؤخذ عينات معقمة بعد 24 ساعة و 48 و 72 لتقرير من التقدم والنمو ونشاط انزيم المنتجة. والمنتج شكلت هو انزيم ذات القيمة العالية β-فركتوفورانوزيداز، وحفاز بيولوجي هام لتشكيل الجدد سكر في المواد الغذائية أو صناعة الأدوية، والذي يحفز من بين أمور أخرى على رد فعل من السكروز إلى جلوكوز 7-9. ولذلك، فإن القياس الكمي للجلوكوز بعد إضافة السكروز ينطوي على قدر من إنتاج فركتوفورانوزيداز-β. يتم تقدير الجلوكوز من قبل الله / POD الفحص-10، والتي يتم تعديلها لتحليل الإنتاجية العالية في لوحات عيار 96-جيدا الصغرى.
يتم فحص مورفولوجيا الفطرية بعد 72 ساعة من قبل المجهر وتتميز تحليل الصور الرقمية. في القيام بذلك، ويتم حساب عوامل شكل جسيمات عن التشكل الكلي الفطرية مثل قطر فيريه، ومنطقة المتوقعة، محيط، دائرية، نسبة الجانب، استدارة صلابة اوند مع صورة مفتوحة المصدر يماغيج برنامج معالجة. يتم الجمع بين المعايير ذات الصلة لعدد الصرف أبعاد (MN) 11، الذي تمكن من توصيف شاملمورفولوجيا الفطرية. وسلط الضوء على علاقة وثيقة من عدد الصرف والإنتاجية من خلال الانحدار الرياضية.
Protocol
Discussion
وكان التعديل من التشكل الفطرية من اهتمام في مجال التكنولوجيا الحيوية منذ عقود عديدة. وقد حاولت دراسات مختلفة لعملية اختيار تختلف المعلمات مثل قيمة درجة الحموضة، ومدخلات الطاقة، ودرجة الحرارة، والمغذيات متوسطة الحجم أو تركيز اللقاح 1، ولكن تعاني من سيطرة غير دقيقة وغير كاملة بدلا من التشكل، ارتفاع تكاليف الطاقة، والآثار تثبيط أو عدم الاستقرار الناتج، وفي المقابل، ومكملات من الجسيمات الدقيقة يسمح للهندسة دقيقة من التشكل الفطرية من خلال صقل تباين حجم الجسيمات وتركيز. هذا يفتح آفاقا جديدة لاستخدام جزيئات متناهية الصغر من أجل التحسين ومصممة خصيصا من تصميم التشكل إنتاج عالية في إنتاج التكنولوجيا الحيوية مع أ. النيجر والكائنات الدقيقة الخيطية الأخرى.
تحليل الصور الرقمية هي وسيلة سهلة للتكرار لوصف الفطرية مورفولوجيا الماكرو. ومع ذلك، فإن العديد من المعلمات لقصص الأطفال الحجم والشكل والسطحيةثالثا البنى الصرفية وصفها في المؤلفات يجعل تقييم سريع للمورفولوجيا الفطرية معقدة. عدد الصرف كما عرضت مجموعة من المعايير ذات الصلة، والابتعاد عن هذا النقص، ويمكن استخدامها ليس فقط لتوصيف شامل لهياكل شكلية، بل أيضا لارتباط الرياضية مباشرة مع الإنتاجية. هذا يجعل من جديد تقدير من الإنتاجية عن طريق التشكل معين، وبالتالي التخصيص من التشكل للالعملية تحتاج ممكن.
باستخدام عدد الصرف، فمن الممكن أن نميز بين مختلف بيليه وmorphologies أجمة 4،5. لمزيد من التطوير لعدد الصرف ومراعاة البعد كسورية ويبدو أن واعدة. والبعد كسورية يعطي قياس لمدى تعقيد والشامل ملء خصائص كائن 13 و predestinated وبالتالي لتوصيف شامل لمورفولوجيا فطر.
على كرeation من مورفولوجية عالية فطر المنتجة، ومع ذلك، قد يؤدي إلى مشاكل مع أداء عملية خاصة في زراعة على نطاق واسع، لأنه قد تم على شكل نمو mycelial أظهرت في وقت سابق لعرض أكبر بكثير اللزوجة مرق ثقافة 2. هذا يؤدي إلى مشاكل مع انتقال الحرارة والكتلة وتشكيل مناطق راكدة غير مختلطة، والتي تتطلب مساهمة أكبر من الطاقة، وجعل زراعة أكثر تكلفة لتشغيل 1. ولذلك ينبغي النظر في العلاقة بين مورفولوجيا الفطرية وثقافة مرق اللزوجة عند تغيير الصرف وإدماجها في نماذج أخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين الامتنان بالدعم المالي المقدم من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) عن طريق مركز البحوث التعاونية SFB 578 "من جين إلى المنتج" في الجامعة التقنية براونشفايغ، ألمانيا.
Materials
Table of Equipment:
| Equipment | Company | Catalogue Number/model |
| autoclave | Systec | V150 |
| Büchner funnel (plastic) | VWR | – |
| cellulose filter (for biomass dry weight) | Sartorius Stedim Biotech | Filter Discs Grade 389 |
| cellulose acetate filter (for air filtration at reactor) | Sartorius stedim biotech | Midisart 200 PTFE |
| cellulose acetate filter (for enzyme activity) | Sartorius Stedim Biotech | Midisart NML |
| centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5415R |
| centrifuge | Heraeus | Biofuge fresco |
| centrifuge | Heraeus sepatech | Varifuge 3.0R |
| compartment dryer (105 °C) | Heraeus | Kelvitran t |
| control unit (temperature) | Jumo | Jumo iTron 08 |
| control unit (pH-value) | meredos | pH Control 2 |
| desiccator | Duran | Vacuum stable |
| Falcon tubes | Omnilab | FALC352070 |
| heating block 40 °C | Biometra | TB1 Thermoblock |
| heating block 95 °C | HLC | HBT 130 |
| micro plate reader | Tecan | Sunrise-Microplate-Reader |
| micro scales | Sartorius | CP 225 |
| microscope (digital inverted) | AMG | EVOS xl |
| micro pipettes and tips (different sizes) | Omnilab | 5283303 5283298 5283299 5283300 |
| micro titer plate | Nunc | MaxiSorp |
| multi pipette and tips | Eppendorf/ Omnilab | 5283611/ 5283611 |
| pH-electrode | Schott | pH-Meter CG840 |
| reaction tubes | Roth | E518.1 |
| scale | Sartorius | CP 3202 S |
| stirred tank bioreactor with equipment | Applikon Biotechnology | 2L Bioreactor set |
| syringe | Eppendorf | Combitips Plus 5 mL |
Table of Reagents:
| Name of the reagent | Company |
| Acetic acid | Roth |
| Disodium hydrogen phosphate | Merck |
| Ethanol (95%) | Roth |
| Glucose monohydrate, (α-D-) | Roth |
| Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger) | Sigma |
| Hydrochloride acid (37 % w/v) | Fiedel-de Haën |
| Hydrous magnesium silicate | Roth |
| Monopotassium phosphate | Merck |
| o-dianoisidine dihydrochloride | Sigma |
| Peroxidase (Typ II from horseradish) | Sigma |
| Sodium acetate | Roth |
| Sodium hydroxide | Merck |
| Sucrose, D-(+) | Fluka |
| Water (deionized) | – |
Table of Solutions and Medium Composition:
| Solution | Components | Amount |
| 50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5) | Sodium acetate Bring to volume with deionized water Adjust at pH 6.5 with acetic acid | 4.1 g L-1 |
| 0.05 M monopotassium phosphate solution | Monopotassium phosphate Bring to volume with deionized water | 6.805 g L-1 |
| 0.05 M disodium hydrogen phosphate solution | Disodium hydrogen phosphate Bring to volume with deionized water | 7.1 g L-1 |
| 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) | 0.05 M disodium hydrogen phosphate solution Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution | 61.2 mL |
| 0.05 M phosphate buffer (pH 5.4) | 0.05M disodium hydrogen phosphate solution Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution | 3 mL |
| 1.65 M sucrose solution | D-(+)-sucrose Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4) | 564.8 g L-1 |
| reagent solution | o-Dianisidin-Dihydrochlorid Ethanol (95%) | 25 mg 10 mL |
| Glucose reagent solution | Glucose oxidase Peroxidase Phosphate buffer (pH 7.0) reagent solution | 10.5 mg 3 mg 90 mL 10 mL |
References
- Wucherpfennig, T., et al. . Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).
- Driouch, H., Hänsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles. Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).
- Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger. Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).
- Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production. Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).
- Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production. Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).
- Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example. Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).
- Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611. Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).
- Rajoka, M. I., Yasmeen, A. Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).
- Zuccaro, A., Götze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering. ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).
- Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose. The Lancet. , 270-368 (1957).
- Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. Morphology engineering – Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity. Microb. Cell Fact. 10, (2011).
- Rasband, W. S. . ImageJ. , (1997).
- Papagianni, M. Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures. Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).
