JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

Published: May 28, 2012
doi:
10.3791/3961
, , ,
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences,McMaster University , 2Department of Chemistry and Chemical Biology,McMaster University

Summary

דיווחנו לאחרונה גישה חדשנית להפקת בדיקות DNAzyme fluorogenic כי ניתן להחיל על הקמת פשוט, "תמהיל-and-לקרוא" assay ניאון לגילוי חיידקי. אלו בדיקות דנ"א מיוחד לזרז את המחשוף של מצע ה-DNA-RNA-chromophore שונה chimeric בנוכחות תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי חיידק מסוים, ובכך לתרגם את גילוי החיידק לדור אותות הקרינה. בדוח זה נתאר את הליכי הניסוי העיקריים שבהם בדיקה DNAzyme מסוים כונה "RFD-EC1" מועסק לצורך זיהוי של החיידק המודל,<emEscherichia coli> (E. coli)</em>.

Abstract

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses each and every year. Prevention of such outbreaks and minimization of the impact of an ongoing epidemic place an ever-increasing demand for analytical methods that can accurately identify culprit pathogens at the earliest stage. Although there is a large array of effective methods for pathogen detection, none of them can satisfy all the following five premier requirements embodied for an ideal detection method: high specificity (detecting only the bacterium of interest), high sensitivity (capable of detecting as low as a single live bacterial cell), short time-to-results (minutes to hours), great operational simplicity (no need for lengthy sampling procedures and the use of specialized equipment), and cost effectiveness. For example, classical microbiological methods are highly specific but require a long time (days to weeks) to acquire a definitive result.1 PCR- and antibody-based techniques offer shorter waiting times (hours to days), but they require the use of expensive reagents and/or sophisticated equipment.2-4 Consequently, there is still a great demand for scientific research towards developing innovative bacterial detection methods that offer improved characteristics in one or more of the aforementioned requirements. Our laboratory is interested in examining the potential of DNAzymes as a novel class of molecular probes for biosensing applications including bacterial detection.5

DNAzymes (also known as deoxyribozymes or DNA enzymes) are man-made single-stranded DNA molecules with the capability of catalyzing chemical reactions.6-8 These molecules can be isolated from a vast random-sequence DNA pool (which contains as many as 1016 individual sequences) by a process known as “in vitro selection” or “SELEX” (systematic evolution of ligands by exponential enrichment).9-16 These special DNA molecules have been widely examined in recent years as molecular tools for biosensing applications.6-8

Our laboratory has established in vitro selection procedures for isolating RNA-cleaving fluorescent DNAzymes (RFDs; Fig. 1) and investigated the use of RFDs as analytical tools.17-29 RFDs catalyze the cleavage of a DNA-RNA chimeric substrate at a single ribonucleotide junction (R) that is flanked by a fluorophore (F) and a quencher (Q). The close proximity of F and Q renders the uncleaved substrate minimal fluorescence. However, the cleavage event leads to the separation of F and Q, which is accompanied by significant increase of fluorescence intensity.

More recently, we developed a method of isolating RFDs for bacterial detection.5 These special RFDs were isolated to “light up” in the presence of the crude extracellular mixture (CEM) left behind by a specific type of bacteria in their environment or in the media they are cultured (Fig. 1). The use of crude mixture circumvents the tedious process of purifying and identifying a suitable target from the microbe of interest for biosensor development (which could take months or years to complete). The use of extracellular targets means the assaying procedure is simple because there is no need for steps to obtain intracellular targets.

Using the above approach, we derived an RFD that cleaves its substrate (FS1; Fig. 2A) only in the presence of the CEM produced by E. coli (CEM-EC).5 This E. coli-sensing RFD, named RFD-EC1 (Fig. 2A), was found to be strictly responsive to CEM-EC but nonresponsive to CEMs from a host of other bacteria (Fig. 3).

Here we present the key experimental procedures for setting up E. coli detection assays using RFD-EC1 and representative results.

Protocol

1. הכנת כימית פתרונות 0.5 מ 'אתילן diaminetetraacetic חומצה (EDTA): ב 2 ליטר (L) כוס פלסטיק, שוקל 186.1 גרם EDTA (EM מדע) ולהוסיף 800 מיליליטר (מ"ל) מים מזוקקים deionized-autoclaved (DDH 2 O). להתאים את ה-pH 8.0 כדי שימוש NaOH כדורי (EM המדע). להפוך את עוצמת הקול הסופי ל 1 באמצעות DDH 2 א ' להעביר את הפתרון בקבוקי זכוכית, החיטוי ו חנות ב 4 ° C. 10 × טריס-borate EDTA פתרון (10 × TBE: 89 מ"מ טריס, 89 mM חומצה בורית, 2 mM EDTA, pH 7.5): שוקל 432 גרם של טריס בסיס (BioShop קנדה) ו 220 גרם של חומצת בור (BioShop קנדה) , ולהוסיף לכל כוס פלסטיק 4 L. מדדו 80 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA (pH 8.0) ומוסיפים כוס. הוסף DDH 2 O לנפח סופי של 4 ל ביסודיות לערבב את הפתרון עם בר סערה מגנטית עד הרכיבים נמס לגמרי. להעביר את הפתרון בקבוקי זכוכית, החיטוי ו חנות ב 4 ° C. 10% denaturing polyacrylamiדה המניות ג'ל: כדי הכוס פלסטיק 4 L, להוסיף 1681.7 גרם של אוריאה (BioShop קנדה), 400 מ"ל של 10 × TBE, 1 ליטר של תמיסת 40% (29:1) acrylamide / bisacrylamide (BioShop קנדה). להתאים את עוצמת הקול כדי L 4 עם DDH 2 א ' ממיסים את אוריאה עם ערבוב. להעביר את הפתרון 1 בקבוקי זכוכית וסעד ענבר לאחסן 4 מעלות ג (Acrylamide Caution! צריכים להיות מטופלים עם כפפות, מסכה, משקפי מגן או חלוק מעבדה כי זה עצבים לפני פילמור). 2 × חיץ ג'ל טוען (2 × GLB): כדי כוס זכוכית 200 מ"ל, מוסיפים 44 גרם של אוריאה, 8 גרם של סוכרוז (BioShop קנדה), 10 מ"ג של כחול bromophenol (BioShop קנדה), 10 מ"ג של xylenecyanol FF (Sigma אולדריץ), 400 μL של סולפט 10% dodecyl נתרן (SDS, BioShop קנדה), ו 4 מ"ל של 10 × TBE. לוויסות עוצמת השמע הסופי 40 מ"ל עם DDH 2 O ו לפזר את מוצקים עם חימום קל (50 ° C) ערבוב עם בר מגנטי. להעביר 1 מ"ל לתוך aliquot 1.5 microcentrifuge צינורות מ"ל ו חנות ב 4 ° C. בהתבסס על שלנוניסיון, יש צורך בחום 2 × בקצרה GLB ב 90 מעלות לפני השימוש, כי 2 × GLB מבצרת בתנאי אחסון. 1 M טריס-HCl (pH 7.5): שוקל 12.1 גרם של בסיס טריס על כוס זכוכית 200 מ"ל. הוסף 60 מ"ל של DDH 2 O ו לפזר את מוצקים על ידי ערבוב עם stirrer מגנטי. להתאים את ה-pH 7.5 כדי שימוש 1 M HCl (Sigma-Aldrich). לפצות את נפח 100 מ"ל עם DDH 2 O ולהעביר לבקבוק זכוכית החיטוי. לאחסן ב 4 ° C. 5 M NaCl: בכוס זכוכית שוקל 58.4 גרם של NaCl (BioShop קנדה) לפזר עם 150 מ"ל של DDH 2 א ' להתאים את עוצמת הקול כדי 200 מ"ל עם DDH 2 א ' להעביר את הפתרון החיטוי בקבוק, זכוכית בחנות ב 4 ° C. Elution מאגר ה-DNA: בכוס כוס, מערבבים 2 מ"ל של 1 M טריס-HCl (pH 7.5), 8 מ"ל של 5 M NaCl ו – 0.4 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA (pH 8.0). להתאים את עוצמת הקול כדי 200 מ"ל עם DDH 2 א ' החיטוי וחנות ב 4 ° C. 2 × התגובה חיץ (2 × RB; 100 HEPES מ"מ, 300 מ"מ, 30 מ"מ NaCl MgCl 2): עד 50 מ"ל פלקון צינור (BD Falcon), להוסיף 1.2 גרם של HEPES (BioShop קנדה), 0.88 גרם של NaCl ו 0.30 גרם של MgCl 2 • 6 שעות 2 O (כימיקלים EMD) ו – 30 מ"ל של DDH 2 א ' מערבבים על ידי ניעור קלה עד הרכיבים נמס לגמרי. להתאים את ה-pH 7.5 ל על ידי הוספת 10 פתרון N NaOH ולהתאים את עוצמת הקול האחרון 50 מ"ל עם DDH 2 א ' לטהר את הפתרון באמצעות יחידת מזרק מונחה פילטר (0.22 מיקרומטר, Millipore) ולאחסן ב 4 ° C. לוריא Bertani (LB) מרק: בכוס, שוקל 20.0 גרם של אבקת LB (Sigma-Aldrich) ואחריו תוספת של L 1 של DDH 2 א ' לערבב היטב את הפתרון עם בר סערה מגנטית, להעביר את הפתרון בקבוק קוני. החיטוי פתרון וחנות בטמפרטורת החדר. אגר LB 1.5%: שוקל 1.5 גרם של אגר (BioShop קנדה) בבקבוק 250 מ"ל ולהוסיף 100 מ"ל של LB נוזלי. החיטוי את התערובת בטמפרטורת החדר. ציפוי אגר: מללא אגר LB במיקרוגל פתרון מגניב ל ~ 50 ° C. יוצקים את הפתרון אל צלחות פטרי (פישר סיינטיפיק) תחת אש. מניסיוננו, 100 מ"ל של אגר LB יכולה להניב 5-6 צלחות. 2. בניית RFD-EC1 ו RFSS1 ידי תבנית בתיווך קשירת אנזימתי RFD-EC1 (איור 2 א) הוא DNAzyme התכונות. הוא מורכב EC1 רצף קטליטי רצף מצע את fs1 (מסומנת בקווים שחורים וירוקים איור 2 א.). RFSS1 (איור 2 א) היא גירסה מקושקשת של RFD-EC1 שם EC1 רצף קטליטי הוא בחלקו גרר לתוך SS1 אבל חלק את fs1 נותר ללא שינוי. RFD-EC1 ו RFSS1 נעשו על ידי מתווך תבנית האנזימטית של קשירת את fs1 oligonucleotide עם EC1 oligonucleotide או SS1 בנוכחות LT1 כתבנית קשירת (ראו תיבה הוכנס איור 2 א.). הליך לביצוע התגובה קשירת מוצג להלן.את fs1 התקבל מתקנים קק Oligo סינתזה באוניברסיטת ייל, deprotected מטוהרים על ידי ג'ל אלקטרופורזה בעקבות פרוטוקול הוקמה קודם לכן. 17-24 EC1, SS1 ו LT1 נרכשו מ-DNA טכנולוגיות משולבות מטוהרים על ידי ג'ל אלקטרופורזה. הכן את 100 המניות מיקרומטר פתרון את fs1, EC1, SS1 ו LT1 באמצעות DDH 2 א ' לאחסן אותן -20 ° C עד השימוש. העברת 5 μL של פתרון המניות את fs1 לשני 1.5 צינורות microcentrifuge μL מסומנים התחתית 1 ו 2 Tube. אל צינור זה, להוסיף 38.5 μL של DDH 2 O ולאחר מכן 5 μL של 10 × קינאז polynucleotide T4 (PNK) חיץ התגובה (MBI Fermentas), המכיל 500 mM Tris-HCl (pH 7.6, 25 ° C), 100 מ"מ MgCl 2, 50 מ"מ DTT, spermidine 1.0 מ"מ. מערבבים את כל הפתרון על ידי pipetting (פיפטה הפתרון מעלה ומטה כמה פעמים). הוסף 1 μL של ה-ATP (100 מ"מ; Fermentas MBI) ומערבבים ידי pipetting. הוסף 0.5 μL של קינאז polynucleotide T4 (PNK, 10 יחידות / μL: MBI Fermentas) ומערבבים ידי pipetting. דגירה של תערובות התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הקפידו לכסות את צינורות בנייר אלומיניום כדי למזער photobleaching של fluorophore. להרוות את התגובה על ידי חימום על 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מצננים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. הוסף 5 μL של EC1 ו SS1 פתרון המניות התחתית 1 ו 2 Tube, בהתאמה. הוסף 5 μL של פתרון המניות LT1 לתערובת כל הצינור, על ידי pipetting. מחממים את תערובת התגובה על 90 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 ומצננים לטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הוספת 118 μL של DDH 2 O ואז 20 μL של 10 × T4 DNA ligase חיץ (MBI Fermentas), המכיל 400 מ"מ טריס-HCl (pH 7.8 במהירות של 25 ° C), 100 מ"מ MgCl 2, 100 DTT מ"מ, ו 5 mM ATP. מערבבים את הפתרון על ידי pipetting. הוסף 2 μL של ligase DNA T4 (5 יחידות / μL: MBI Fermentas) ומערבבים ידי pipetting. דגירה של תערובות התגובה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. הוסף 20 μL של 3 מ 'NaOAc (pH 7.0) כדי מערבולת כל צינור, ספין למטה. הוספת 500 μL של אתנול 100% קר צינור אחד, לערבב את הפתרון על ידי vortexing ומניחים צינורות במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בצנטריפוגה תערובות ב g 11,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה בקירור (אלגרה X22-R, Beckman Coulter) ובזהירות להסיר את supernatant ידי pipetting. לייבש את ה-DNA באמצעות גלולה concentrator DNA (DNA Savant Speedvac, Thermo Scientific) עבור 10 דקות. כדורי Resuspend הגנטי של μL 30 של 1 × חיץ ג'ל טוען (GLB), בקצרה מערבולת ומסובב את עם צנטריפוגות benchtop (Minicentrifuge, VWR מדעי). דגימות דנ"א ligated מוכנים טוען על ג'ל dPAGE 10%. 3. הכנת ג'ל dPAGE 10% השלבים הבאים מתארים בקצרה את המנגנון של אלקטרופורזה בג'ל שלה הגדרת. לפרטים יותר לגבי הגדרות, מנגנון וטיפול, עיין לאהו הפרוטוקולים שפורסמו בעבר שלנו. 30,31 לשטוף ולייבש שני לוחות זכוכית, שני מפרידי 0.75 מ"מ מסרק 16-היטב. להרכיב צלחות זכוכית מפרידי עם קליפים ולהניח במאוזן על משטח שטוח עם צלחת זכוכית מחורצת פונה כלפי מעלה. להעביר 40 מ"ל של תערובת dPAGE 10% תוך הכוס 150 מ"ל. הוסף 40 μL של tetramethylethylenediamine (TEMED; Bioshop קנדה), 400 μL של APS 10%, ומערבבים על ידי מתערבל עם pipettor. יוצקים את התערובת בזהירות בין הצלחות ומיד להכניס את המסרק. לאפשר לתערובת לפלמר עבור 10 דקות עד 20. פילמור יכול להיות מאושרת על ידי בדיקת תמהיל ג'ל שיורי השאיר בכוס. מפולמר פעם, להסיר את המסרק בעדינות ולשטוף בארות עם DDH 2 O להסיר הפתרון ג'ל השיורי וולס. הר את הצלחות על מנגנון ג'ל אלקטרופורזה עם צלחת מלבנית unnotched פונה החוצה במקום לוחית מתכת מאחורי הצלחת מחורצים. השימוש PL מתכתאכלו מסייעת במניעת התחממות יתר אשר יכול לפצח את לוחות הזכוכית. הוסף 1 TBE × לתאי העליון והתחתון של המכשיר. בדוק כדי להבטיח את בארות מלאים למאגר והקצה התחתון של הג'ל הוא שקוע בתוך המאגר. החלת 40 mA (או 750 V) הנוכחי מראש לרוץ 10 דקות עד 15. 4. טיהור Ligated RFD-EC1 ו RFSS1 ידי ג'ל dPAGE 10% בעקבות הצעד של 3.7, לשטוף עם בארות 1 × TBE באמצעות מזרק ומחט. טען את תערובת קשירת RFD-EC1 ושל RFSS1 (מ 2.13) ל 2 בארות (1 לכל אחד) באמצעות pipettor וטעינה ג'ל טיפים (Diamed). החלת 40 mA (750 V) הנוכחי עד צבע התחתון (bromophenol כחול) הוא כ 5 ס"מ מעל הקצה התחתון של הצלחות. הסרה של לוחות זכוכית מן המנגנון פועל ג'ל, לשכב על ספסל שטוח להסיר בזהירות את מפרידי. מוציאים בזהירות את לוחות הזכוכית למעלה מ ג ועוטפים בניילון נצמד ג'ל (מנסים להימנע קמטים מתקפלים של עוטפת על ג'ל). המוצרים ligated ניתן דמיינו באמצעות הצללה UV (260 ננומטר) או שקוף (360 ננומטר), אשר תפיק הלהקה DNA הנראה כמה סנטימטרים מעל EC1 או SS1 (100 pmol של EC1 או SS1 יכול לשמש כסמן ו נטען לתוך היטב בשלב של 4.2). סמן את להקות ה-DNA הרצוי עם הסמן. להקת בלו ה-DNA עם סכיני גילוח סטריליים, לחתוך ג'ל לחתיכות קטנות והעברת לתוך צינור microcentrifuge טריים 1.5 מ"ל. לרסק את חתיכות ג'ל בתוך הצינורית microcentrifuge באמצעות קצה פיפטה סטרילית (200 גודל עצה μL). הוספת 500 חיץ μL elution DNA למבחנה כל ולכסות אותם בנייר אלומיניום כדי להגן על fluorophores מן האור. המערבולת דגימות עבור 10 דקות. צנטריפוגות מדגמים ב g 11,000 דקות 4 על 4 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה בקירור (אלגרה X22-R, Beckman Coulter) ובזהירות להעביר 350 μL של ה-Supernatant כדי צינור טרי מ"ל 1.5 microcentrifuge (אם יש צורך, elution 2 אפשר לעשות עם 350 μL מאגר elution טרי 10 דקות אחר). הוסף 35 μL (0.1 × נפח דגימה) של M 3 נתרן אצטט (NaOAc, pH 7.0) על צינור אחד, על ידי שילוב vortexing ומסובב למטה. הוספת 900 UL של 100% אתנול קר צינור אחד. מערבבים את כל מדגם ביד רועדת צינור במשך כמה שניות. מניחים את צינורות ב -20 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1. צנטריפוגות מדגמים ב g 11,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה בקירור ובזהירות להסיר את supernatant ידי pipetting. הוספת 100 μL של אתנול 70% קר ולהשתמש בו כדי לשטוף בעדינות את הקיר הפנימי של כל הצינור. Re-צנטריפוגות ב g 11,000 דקות 7 ב 4 ° C. הסר את supernatant ולייבש באמצעות גלולה concentrator DNA עבור 10 דקות. ממיסים את כדורי ה-DNA של 100 μL של DDH 2 O ו מערבולת. קבע את ריכוז ה-DNA מבוסס על ספיגת UV ב 260 ננומטר. החנות דגימות ב -20° C עד השימוש. 5. הכנת חיידקים היעד זן חיידקי E. coli K12 (MG1655) ו זנים בקרה רלוונטיות מצופה ראשית ממניות וגליצרול על צלחות אגר פאונד. תחת אש או בתוך ארון בטיחות ביולוגית, לגעת המניות גליצרול חיידקי עם קצה פיפטה סטרילית בעדינות פס על פני השטח את הצלחת כדי למנוע נזק אגר LB. מרחב צלחות שטופי מים דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות. לאחר הדגירה, לאטום את המערכת כולה של הצלחות עם Parafilm (אריזות פלסטיק Pechiney) ולאחסן ב 4 ° C. לוחות אלה ניתן לאחסן לכל היותר 4 שבועות. 6. הכנת תערובות תאי גולמי (CEMS) לוותר על 2 מ"ל של LB ל -14 צינורות סטריליים מ"ל תרבות (BD פלקון) באמצעות אקדח פיפטה (Corning). משתמש קצה פיפטה סטרילית, לקחת קולוניה אחת מהצלחת אגר מוכן בשלב של 5.2 ו להכניס אותו לתוך ה-ACulture צינור. צינורות מקום באינקובטור (ניו ברונסוויק מדעי) נקבע על 37 מעלות צלזיוס, וללחוץ על סל"ד 250 עבור 14 שעות. 1 מחדש חיסון התרבות%: לוותר על 2 מ"ל של LB טרי ל -14 מ"ל צינורות תרבות ספייק עם μL 20 של תרבויות חיידקים מוכנים בשלב 6.2. דגירה צינורות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד בסל"ד 250 עד שכל פתרון חיידקי מגיע OD 600 (צפיפות אופטית נמדד ב 600 ננומטר) של כ 1. כדי למדוד OD 600, להעביר 1 מ"ל של תרבות כל קובט חד פעמי ספיגת מדד ב -600 ננומטר עם ספקטרופוטומטר UV (Genesys UV 10, Thermo Scientific). להעביר 1 מ"ל של כל תרבות על צינור 1.5 מ"ל חדשה microcentrifuge ותאי גלולה ידי צנטריפוגה ב g 11000 5 דקות בטמפרטורת החדר. העברת supernatant ברור צינור מ"ל טריים 1.5 microcentrifuge וחנות ב -20 ° C אם לא נעשה שימוש באופן מיידי. 7. זיהוי באמצעות ספקטרופוטומטר Fluorescence הפעל ספקטרופוטומטר הקרינה (קרי ליקוי חמה, וריאן Inc) ולהגדיר את הנתונים פרמטרים רכישה עם עירור ב 488 ננומטר ופליטות ב 520 ננומטר. קריאות ניתן לקחת בכל רגע את H 1. לשטוף 3 cuvettes קוורץ קריסטל (וריאן קארי) עם DDH 2 O, ואחריו אתנול 100%. לייבש את cuvettes ידי מהבהב גז חנקן. Cuvettes לייבל C1 (שלט 1), C2 (שלט 2) ו-T (מבחן). העברת 24 μL של DDH 2 O ל C1 ו 24 μL של CEM-EC כדי C2 וט הוסף 25 μL של 2 × RB אל קובט כל ומניחים אותם ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי. להתחיל לאסוף נתונים הקרינה דקות 5 1. הוסף 1 μL של RFSS1 (מתוך 5 המניות פתרון מיקרומטר) ל C2 ו 1 μL של RFD-EC1 (מתוך 5 המניות פתרון מיקרומטר) ל T ו-C1. מערבבים את כל הפתרון על ידי pipetting. זה חייב להיות יזם בקפידה כך קריאות הקרינה לא התערב. אפשר התגובה להמשיך עד סוף הזמן H 1 הרכישה. להצילאת הנתונים בתבנית קובץ Excel, להעביר את הנתונים למחשב אישי נתוני התהליך כדי ליצור תמונה גרפית. 8. זיהוי על ידי ג'ל אלקטרופורזה תערובות את אותה תגובה שהוכנו בשלב 7.4 ניתן להשתמש לצורך ניתוח על ידי ג'ל אלקטרופורזה, לחילופין תגובות חדשות ניתן להכין בצורה דומה ו מודגרות ב 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל. כך או כך: תגובות להרוות (לאחר 1 שעה) על ידי הוספת 5 μL של 3 מ 'NaOAc ו 125 μL של אתנול 100%. מערבבים את כל הפתרון על ידי vortexing ומניחים צינורות למקפיא -20 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה. בצנטריפוגה תערובות התגובה ב g 11,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C, להסיר בזהירות supernatant ידי pipetting. לייבש את כדורי באמצעות concentrator DNA עבור 10 דקות. כדורי Resuspend ב μL 20 של 1 × GLB על ידי לחיצה קצרה vortexing. לסובב את הצינורות לזמן קצר מאוד עם צנטריפוגות benchtop (Minicentrifuge, VWR מדעי). דגימות אלה נקראיםY לטעינת לתוך הג'ל dPAGE. הכן ג'ל dPAGE 10% כמתואר 3.1-3.7. טען דגימות התגובה (משלב 8.4) לתוך הבארות באמצעות pipettor וטעינה ג'ל טיפים (Diamed). החלת 40 mA (750 V) הנוכחי עד צבע התחתון (bromophenol כחול) הוא כ 5 ס"מ מעל הקצה התחתון של הצלחות. הסרה של לוחות זכוכית ולשטוף היטב במים מהברז כדי להסיר את כל החלקים ג'ל. נגב צלחות עם kimwipe (Kimberly-Clark Professional). סרוק את הצלחת ג'ל על הקרינה באמצעות סורק טייפון (Typhoon 9200, מצב משתנה, GE Healthcare). לנתח את הנתונים באמצעות תוכנה ImageQuant (דינאמיקה מולקולארית). 9. גילוי ספציפיות לבדיקת הספציפיות חיידקים, אותם הליכים המתוארים לעיל culturing א ' coli, הכנת CEM שלה וביצוע assay בתגובה מחשוף ניתן לבצע במשך מספר זני חיידקים שונים כגון B. subtilis, פ 'פלאי, י ruckeri, ל עמ'lanturum, פ acidilactici (מוצג איור 3 א.). 10. תא בודד לזיהוי הכן 1 מ"ל E. גליצרול coli מלאי של 2 CFU / מ"ל (CFU: המושבה להרכיב יחידה) על ידי דילול סדרתי ואשר ריכוז CFU ידי ציפוי 5 המניות זה אמור להכיל 0.2 CFU/100 μL.. חנות ב -80 ° C עד השימוש. הכן 10 מבחנות המכילות 2 מ"ל תרבות של LB. לחסן כל תרבות עם μL 100 מניות CFU / mL 2 גליצרול דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רועד בסל"ד 250. השימוש המניות גליצרול כולו (1 מ"ל) יש 10 להניב תרבויות. 300 קציר μL מהצינור כל תרבות מחוסן בנקודות הזמן הבאות: 4, 8, 12, 16 ו 24 שעות. השאירו את התרבות הנותרים לגדול במשך 24 שעות. למדוד את OD 600 ו להאיץ את התאים על ידי צנטריפוגה ב g 11,000 דקות 5. להעביר את CEMS כדי טריים 1.5 microcentrifuge צינורות מ"ל ו -20 חנויות ב & Dלמשל: C עד השימוש. הערה: מאחר ולא יהיה בה שום OD לזיהוי 600 עבור דגימות שנקטפו בזמן נקודות 4, 8 ו -12, לאפשר לתרבות הנותרים לגדול במשך 24 שעות על מנת לזהות תרבויות המכילים חיידקים (נקבע על ידי מדידת עכירות ו OD). רק אחד או שניים מתוך 10 התרבויות עשוי להכיל E. coli לאחר חיסון ואת צינורות הנותרים לא מכיל תאים. השתמש CEMS שהתגלו תרבויות חיוביות (מאוחסן ב -20 ° C) בבית timepoints המיועדים להכנת תגובות מחשוף עם RFD-EC1 ולאחר מכן לנתח את תערובות התגובה באמצעות ג'ל אלקטרופורזה dPAGE כפי שתואר בסעיף 8. 11. הרעיון נציג תוצאות הרעיון של ניצול DNAzyme RNA-ביקוע ניאון (RFD) לגילוי חיידקי מתוארת באיור. 1. RFD המסלקת chimeric DNA / RNA על מצע RNA בודד הצמדה (כחול R) בין שני נוקלאוטידים המסומניםעם fluorophore (F) quencher (Q), בהתאמה. כמו חיידק עניין (כגון E. coli) גדל בתקשורת, זה ישאיר תערובת תאי גולמי (CEM). CEM זה כולה לאחר מכן נעשה שימוש בניסוי בחירה חוץ גופית ב להשיג RFD כי הוא קשוב במיוחד כדי CEM, ככל הנראה RFD אינטראקציה עם מולקולה מסוימת (הכוכב הסגול) ב CEM כי הוא מולקולה חתימתו של החיידק. כאשר CEM מתווסף פתרון התגובה המכיל שליד הבית הופיעה, זה מעורר את פעילות RNA-ביקוע של RFD. האירוע מחשוף מפריד F מ ש, וכתוצאה מכך אות ניאון כי ניתן לאתר גם באמצעות fluorimeter או על ידי ג'ל אלקטרופורזה. אימות ניסיוני של המושג הנ"ל נעשה CEM מ א coli (CEM-EC). השגנו 3 מולקולות RFD דרך בבחירת במבחנה, 1 היעילה ביותר יועד RFD-EC1 (איור 2 א). 5 Wבדקה ה פעילות המחשוף של RFD-EC1 (יחד עם רצף מוטנטי בשם RFSS1) בתגובה CEM-EC. שניהם RFD-EC1 ו RFSS1 הוכנו על ידי קשירת האנזימטית של מנות DNAzyme למצע את fs1 (כל רצפי מוצגים איור. 2 א). בניסוי למדידת הקרינה (איור 2 ב), CEM-EC הודגר לבד 5 דקות, ולאחר מכן על ידי תוספת של RFD-EC1 או RFSS1, ועל ידי הדגירה נוספת 55 דקות יותר. עוצמת הקרינה של הפתרון היה כל הזמן לקרוא כל דקה את הנתונים ששימש לחישוב הקרינה היחסית (RF, המחושב כיחס בין עוצמת הקרינה בזמן t לעומת עוצמת הקרינה בזמן 0). ערכי ה-RF מול בזמן הדגירה הם זממו כמו איור. 2B. נמצא כי RFD-EC1 המיוצר על רמה גבוהה של אותות הקרינה על תוספת של CEM-EC, בניגוד מוחלט, RFSS1 לא לייצר אותות הקרינה חזקה. לכן, הקרינה לייצור פוnction של RFD-EC1 על יצירת קשר עם CEM-EC הוא רצף ספציפי. על מנת לוודא כי עליות פלואורסצנציה נצפו הן בשל המחשוף של הצמדה RNA, ניתחנו תערובות התגובה dPAGE. המחשוף של RFD-EC1 צפויה לייצר שני קטעי DNA, "שבר שמירה fluorophore ו 3 '5 שבר שמירה quencher. Uncleaved רק RFD-EC1 (unclv) ו שבר א 5 (CLV) ניתן היה לזהות באמצעות דימות פלואורסצנטי. התוצאה dPAGE באיור. 2C מגלה את תערובת התגובה של RFD-CEM EC1 ו-EC אכן הפיק את המוצר מחשוף הצפוי, תוך תערובת RFSS1/CEM-EC לא. הספציפיות של RFD-EC1 נבדק באמצעות CEMS שנאספו כמה חיידקים גרם שליליים אחרים גרם חיוביים נתונים באיור. 3 א. רק מדגם המכיל CEM-EC (כחול עקומת) המיוצר על עלייה פלואורסצנטי. חוסר תגובתיות צולבת עם CEMSמן חיידקים אחרים עולה כי RFD-EC1 הוא סלקטיבי מאוד עבור ה coli. בחנו גם את הזמן הנדרש עבור culturing א 'אחת coli התא כדי לייצר CEM די בכך יכול לגרום המחשוף של RFD-EC1. לצורך ניסוי זה, א ' מדגם coli המכיל מוגדר CFU (Colony יוצרי יחידות) היה מדולל כראוי כדי להשיג את הריכוז של 1 CFU / mL. זאת בעקבות ערבוב 100 μL המדגם חיידקי בדילול מלא עם התקשורת צמיחה culturing זה 4, 8, 12, 16 ו – 24 שעות. CEMS נאספו אז לכל timepoint ונבדקו על זירוז פעילות המחשוף של RFD-EC1. התוצאה dPAGE באיור. 3 ב עולה כי זמן culturing של 12 שעות יש צורך. חשוב לציין כי הגידול הראשוני אות קטנה שנצפתה מדידות הקרינה לאחר תוספת של רצף RFSS1 (כביקורת שלילית) ל-CEM EC (איור 2 ב, אדום הכמתמ"כה) או RFD-EC1 כדי CEMS חיידקים אחרים (איור 3 ב: כל העיקולים מלבד כחול) מיוחסת הקרינה הפנימית של מודול FRQ (עקב מרווה חלקית של F על ידי Q). לפיכך, צפוי כי תוספת של F-ו-Q-שכותרתו רצפים תייצר גידול הקרינה הראשונית. עם זאת, רק תערובות RFD-EC1/CEM-EC מסוגלים לייצר רמה גבוהה של הקרינה לאורך זמן. באיור 1. איור סכמטי של בדיקה RNA-ביקוע ניאון (RFD) DNAzyme כי מאיר במגע עם תערובת תאי גולמי (CEM) המיוצר על ידי תאים חיידקיים מסוימים של עניין. RFD המסלקת chimeric DNA / RNA על מצע RNA בודד הצמדה (כחול R) בין שני נוקלאוטידים שכותרתו עם fluorophore (F) quencher (Q), בהתאמה. לפני התגובה המחשוף, רמת הקרינה של RFD הוא מזערי בשל prox קרובimity של F ו ש עם מחשוף, Q יוצא מ F, וכתוצאה מכך, אות הקרינה חזקה מיוצר. איור 2. א ' coli חישה RFD. (א) RFD-EC1 היא בדיקה DNAzyme שיכול להיות מופעל על ידי CEM-EC. RFSS1 הוא רצף מעורבל של RFD-EC1 לשמש מלאה. RFD-EC1 ו RFSS1 יוצרו על ידי ligating את fs1 עם EC1 ו SS1, בהתאמה, בנוכחות LT1 כתבנית. פריץ: fluorescein-דיאוקסיתימידין שונה. ש: Dabcyl-דיאוקסיתימידין שונה. R: ribonucleotide אדנין. (ב) Fluorescence איתות פרופילים של RFD-EC1 ו RFSS1 בנוכחות CEM-EC. (ג) dPAGE ניתוח התגובה תערובות מחשוף ב ב '(זמן תגובה: 60 דק'). בתמונה היא תמונה הקרינה של ג'ל dPAGE להשיג עם על ידי סורק טייפון. ליין NC: RFD-EC1 או RFSS1 במאגר התגובה לבד; ליין CEM-EC: RFD-EC1 או RFSS1 במאגר התגובה המכיל CEM-EC. סמן: RFD-CE1 מטופלים עם 0.25 N NaOH, הליך ידוע כגורם המחשוף המלא של RNA. unclv: uncleaved RFD-EC1. CLV: שבר מחשוף המכיל fluorophore. איור 3 (א) Fluorescence איתות פרופיל של RFD-EC1 ב CEMS שהוכנו מתאי חיידקים שונים. הנציבות האירופית: Escherichia coli-K12, PP: Pseudomonas פלי, BD: Brevundimonas diminuta, HA: Hafnia alvei; YR: Yersinia ruckeri; OG: Ochrobactrum grignonese; AX: Achromobacter xylosoxidans, MO: Moraxella osloensis, AI: Acinetobacter lwoffi: SF: Serratia fonticola: BS: subtilis בצילוס;-LM: mesenteroides Leuconostoc: LP: planturum לקטובצילוס, הרשות הפלסטינית: Pediococcus acidilactici: AO: Actinomyces orientalis. מדגם זה CEM הודגר 5 דקות לאחר מכן על ידי תוספת של RFD-EC1. (ב) dPAGEאנליזה של תערובות RFD-EC1/CEM-EC אחרי התגובה של 60 דקות. ליין NC1: RFD-EC1 במאגר התגובה לבד. ליין NC2: RFD-EC1 במאגר התגובה המכיל CEM-BS (CEM להכינו subtilis בצילוס). נתיבי שכותרתו עם 4, 8, 12, 16 ו 24: RFD-EC1 במאגר התגובה המכיל CEM-EC מתוך התרבות חיידקי E. המכיל אחד coli התא לאחר תקופה גדל והולך של 4, 8, 12, 16 ו – 24 שעות, בהתאמה.

Discussion

רוב השיטות המקובלות לזיהוי חיידקים היום הם איטיים או (חיידקים קלאסי) או טכנית בדרישה (נוגדנים, PCR). לכן, אנו מאמינים כי הדור הבא של כלי איתור צריך לספק מהירות כלפי ופשטות. לצורך כך, יצרנו RNA-השחיטה ואת הקרינה, איתות DNAzyme שיכולים לשמש לפיתוח מבחני פשוטים לדווח נוכחות של חיידקים דרך הדור האות פלואורסצנטי. התכונות DNAzyme בדיקה, RFD-EC1, מופעל על ידי CEM הנוצר במהלך הצמיחה של א ' coli בתקשורת ובתרבות. מאז השיטה שלנו משתמשת בתערובות תאיים הגולמי של חיידק כיעד של איתור עוקף את מיצוי היעד מייגע וצעדים הגברה, ניתן להשתמש בו כדי להגדיר פשוט מאוד, "תמהיל-and-לקרוא" סוג של מבחני לגילוי חיידקי. השימוש DNAzyme שלנו אינו מוגבל בשיטה המבוססת על זיהוי הקרינה. לדוגמה, זיהוי colorimetric באמצעות אותה מערכת DNAzyme assay גלהיות מתוכנן בשיטה דיווחו בעבר כי מנצל הגברה מעגל מתגלגל יחד עם צבע אורגני. 32 אנו צופים את השימוש DNAzymes לגילוי חיידקי כמו השדרה אטרקטיבי ליצור biosensors חיידקים חדשים עם פשטות תפעולית גדולה יותר.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מימון עבור עבודה זו ניתן על ידי למדעי הטבע וההנדסה המועצה למחקר בקנדה (NSERC) וברשת ביו סנטינל נייר.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number or model
Agar BioShop Canada AGR003
Ammonium persulfate (APS) BioShop Canada AMP001
Acrylamide/Bis-acrylamide (40%, 29:1) BioShop Canada ACR004
Boric acid BioShop Canada BOR001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
EDTA EM Science EXO539-1
HCl Sigma-Aldrich 38281
HEPES Bioshop Canada HEP001
LB broth Sigma-Aldrich L3022
MgCl2 EMD Chemicals B10149-34
NaCl BioShop Canada SOD002
NaOAc EMD Chemicals SXO255-1
NaOH EMD Chemicals SXO590-1
SDS BioShop Canada SDS001
TEMED BioShop Canada TEM001
Tris-base BioShop Canada BST666
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Urea BioShop Canada URE001
Xylenecyanol FF Sigma-Aldrich X4126
DNA concentrator Thermo Scientific Savant DNA SpeedVac 120
Millex filter unit Millipore SLGP033RS
Gel loading tips Diamed TEC200EX-K
ImageQuant software Molecular Dynamics Version 5.0
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34705
Mini Vortexer VWR 58816-121
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM996
Petri dishes Fisher Scientific Fisherbrand 08-757-12
Stripettor Plus (Pipette gun) Corning 07764714
Quartz cuvettes Varian Inc 66-100216-00
Shaker/Incubator New Brunswick Scientific Classic Series C24
Typhoon Scanner GE Healthcare 9200 Variable mode
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X22-R
UV Spectrophotometer Thermo Scientific GenesysUV 10
Fluorescence Spectrophotometer Varian Inc Cary Eclipse
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. . Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. , (2008).
  2. Call, D. R. Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays. Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).
  3. Lazcka, O., Campo, D. e. l., J, F., Muñoz, F. X. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).
  4. Velusamy, V. An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors. Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).
  5. Ali, M. M. Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  7. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional Nucleic Acid Sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  8. Li, Y., Lu, Y. . Functional Nucleic Acids for Analytical Applications. , (2009).
  9. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  10. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  11. Joyce, G. F. Forty Years of In Vitro Evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).
  12. Breaker, R. R., Joyce, G. F. A DNA enzyme that cleaves RNA. Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).
  13. Cuenoud, B., Szostak, J. W. A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity. Nature. 375, 611-614 (1995).
  14. Chinnapen, D. J., Sen, D. A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).
  15. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  16. Silverman, S. K. DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).
  17. Mei, S. H. An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling. J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).
  18. Liu, Z. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  19. Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme. Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).
  20. Rupcich, N. Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes. J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).
  21. Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme. Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).
  22. Chiuman, W., Li, Y. Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores. J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).
  23. Chiuman, W., Li, Y. Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction. Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).
  24. Shen, Y. Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure. Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).
  25. Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. Characterization of pH3DZ1 – An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3. Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).
  26. Chiuman, W., Li, Y. Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates. Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).
  27. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design. PLoS ONE. 2, e1224 (2007).
  28. Shen, Y. Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing. Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).
  29. Kandadai, S. A. Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5. Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).
  30. Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification. Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).
  31. Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications. Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).
  32. Ali, M. M., Li, Y. Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).

Tags

Bacteria DetectionFluorogenic DNAzymesOutbreaksFood-borne PathogensHospital-acquired PathogensAnalytical MethodsPathogen DetectionHigh SpecificityHigh SensitivityShort Time-to-resultsOperational SimplicityCost EffectivenessClassical Microbiological MethodsPCR-based TechniquesAntibody-based TechniquesScientific Research

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961, doi:10.3791/3961 (2012).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image