SPLINTERを使用してプールされたシーケンスからレアゲノム変異の検出

このメソッドは、Vallania FML らゲノム研究、2010年に報告された研究で使用されています。 1。サンプルプーリングと標的遺伝子座のPCRキャプチャあなたのプール（s）の各個体からゲノムDNAの正規化された量を兼ね備えています。 PCR反応の一人当たりDNA 0.3 ngを使用して、プール内の対立遺伝子ごとに均一な増幅の可能性を向上させ、それぞれのPCR反応に一人当たり約50倍のゲノムを組み込む予定。 ゲノム配列は、NCBI（から入手できますhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）またはUCSCゲノムブラウザ（ http://genome.ucsc.edu/index.html ）。 使用していることを確認し反復領域のプライマーを設計避けるために、シーケンスを取得する"RepeatMasker"（ "N"にマークされている）。 WebベースのPrimer3のを使用します（rimer3/input.htm "ターゲット=" _blank "> http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm）ユーティリティの関心に加えていくつかの隣接配列のゲノム領域をカットアンドペーストしてプライマーを設計する（のアンプリコン600-2000 bp）は一般的に理想的ですが使用するプライマー3の最適なプライマー設計の条件は10です：最小プライマーのサイズ= 19;最適なプライマーのサイズ= 25;最大プライマーのサイズ= 30、最小のTm = 64℃、最適のTm。 = 70°C、最大のTm = 74℃、最大のTmの差= 5°C、最小GC含量= 45、最大のGC含量= 80、（これは任意です）= 20を返すための番号。最大3 '末端の安定性= 100関心のあるすべての遺伝子座を増幅する。デザインプライマーのプライマーを受信するには、凍結乾燥した株はDDHの追加10：01希釈し、続いて100μMの最終濃度を10 mMトリス、pH 7.5 + 0.1mMのEDTAで希釈することができる2 Oは10 uMの。 PCR増幅：我々は、高忠実度DNAポリメラーゼの使用は大きなゲノムを増幅することをお勧めします低エラーレート（10 -7）と平滑末端製品（これは下流のライゲーションのステップが必要である）の生成に起因するアンプリコン。我々はPfuUltraハイフィデリティを使用しているが、同様の特性（备考など）を有する酵素は、同等の結果を提供する必要があります。各PCR反応は、2.5 U PfuUltraハイフィデリティポリメラーゼの最終濃度は、1 Mのベタイン、400 nMの各プライマー、200μMのdNTP、1×PfuUltraバッファ（または≥2 mMのMgの2 +の順序で酵素の忠実度を維持するために含有する緩衝液）が含まれています、50μLの最終容量でプールされたDNAの5から50 ngの。 1：以下のPCR条件を使用しています。 93から95℃で2分間、2。 30秒間93から95°C; 3。 30秒間58から60°C; 4。 65から70°のアンプリコンは500から1000塩基対/アンプリコン> 1キロバイトのための3-5分の250から500 BP / 1.5から3分のアンプリコンのために60〜90秒のC 5。繰り返し25から40サイクルの2-4を繰り返します6。 65°Cで10分間7。 4°Cホールド。必要に応じて、PCRの結果は一般的に向上させることができます：1）小さなアンプリコンのアニーリング温度を下げること、2）大規模なアンプリコンのためのアニーリング温度を上げる3。すべてのアンプリコンの拡張時間を長くする。 スプリンターコントロールの準備：すべてのスプリンター実験が陰性及び陽性対照の存在は、最適な精度を取得する必要があります。ネガティブコントロールは、以前（ハップマップのサンプルなど）が配列決定された任意の個々の、バーコード、サンプル中のすべてのホモ接合体のベースの位置で構成することができます。ポジティブコントロールは、2つ以上のそのようなサンプルの混合物から成るでしょう。このレポートでは、ネガティブコントロールでは、M13mp18 ssDNAのベクトルのバックボーンから1934 bpの増幅領域です。 PCR産物は配列変異は、ソースの材料またはPCR増幅から存在しないことを確認するために前にその使用にサンガー配列決定した。ポジティブコントロールは、特定の挿入、欠失、substitと設計挿入クローン化された72 bpのをpGEM-Tイージーベクターのパネルで構成されていますutions（ 表1）。我々は、モル比で、野生型の背景に一緒にベクトルを混在させる変異は、プール内の単一の対立遺伝子（すなわち、100対立遺伝子プールに対して、単一の対立遺伝子の頻度は1％になります）の周波数で存在しているような。その後、PCRは、最終的な355bp長いPCR産物を生成し、をpGEM-TイージーでM13 PUCプライマー部位を用いて混合するコントロールテンプレートを増幅する。 2。プールされたPCRライブラリーの作製とシーケンシング PCR産物のプーリング：各PCR産物は、過剰なプライマーをクリーンアップする必要があります。我々は、大規模なクリーンアップのための真空マニホールドでキアゲンをQIAquickカラム精製または96ウェルフィルタープレートを使用していました。精製後、各PCR産物は、標準的な技術を用いて定量化する必要があります。濃度でプールのように分子の数で規格化されたプールにすべてのPCR産物（コントロールを含む）を組み合わせて、小さなアンプリコンOVのoverrepresentationになりますERより大きい製品。濃度は、式を用いて体積あたりのDNA分子の絶対数に変換されます。（G /μL）×（1モルX BP / 660グラム）×（アンプリコンの1 /＃BP）×（6×10 23分子/ 1モル）=分子/μL。その後、プールにリコン当たりの分子の正規化数を必要とし、各反応からボリュームを決定します。この番号は、任意である調整することができ、本当に精度を維持するのに十分な大きさのボリュームをピペッティングによって異なります。我々は、通常、それぞれのアンプリコンの1〜2×10 10分子のプール。 PCR産物のライゲーション：この手順では、小規模なPCRアンプリコンの超音波処理は、それらの端部に向かって表現をバイアスするので、均一なシーケンスカバレッジを達成する必要があります。これを克服するために、我々は、断片化の前に大規模なコンカテマー（> = 10 KB）にプールされたPCR産物をライゲーション。 PFUウルトラHFポリメラーゼは、効率的なライゲーション（Taqポリメラーゼベースのポリメラーゼはなりません3P "A"オーバーハングを追加します。につながる、平滑末端を生成する必要に応じて ）記入または鈍化前なしLLOWライゲーション。 この反応は2〜3倍にスケールアップすることができます 。ライゲーション反応は、50μLの最終容量にプ​​ールされたPCR産物の2μgに、10 U T4ポリヌクレオチドキナーゼ、200 U、T4リガーゼ、15％（w / v）のポリエチレン、1X T4リガーゼ緩衝液、グリコール8000 MWを含んでいます。反応は20分間65°Cに続いてと°C、その後4℃で開催された16時間22℃でインキュベートされています。このステップの成功は1％アガロースゲルにサンプルを50 ngをロードすることによって確認することができます。成功したライゲーションは、レーンの高い分子量のバンドが存在し（ 図2、レーン3参照）になります。 DNAが断片化：この時点では、PCR産物の大コンカテマー（> 10キロバイト）を持っている必要があります。我々は24サンプルDiagenodeの断片化の超音波を用いたランダム超音波戦略を持っている断片は25分でこれらのコンカテマー（40秒毎分/ 20秒 "オフ" "オン"）することができます。超音波は、そう、PEGによって導入された粘度によって阻害されるこれは、キアゲンPBバッファにサンプル10:1希釈することによって克服することができます。結果は、2％アガロースゲル（ 図2を参照して 、レーン4＆5）で確認できます。 サンプルは、 "エンド修復"の手順で始まるイルミナゲノムライブラリーのサンプル調製プロトコルに直接組み込むことができるようになります。ここで報告されたデータは、シングルエンドからイルミナGenome AnalyzerのIIxは上の読み取りですが、我々はHiSeq 2000を使用し、単一またはペアエンドは同等の結果を読み込み、実行しました。作成したライブラリの規模を考えると、我々はまた、HiSeqプラットフォーム（データは示さず）によって供給される帯域幅に対応するために、多重化、複数のプールされたライブラリにするためのカスタムバーコードのアダプターを使用しています。製造元のプロトコールとキットに同梱されている推奨事項に従ってください。ために、対立遺伝子あたり25倍以上のターゲット範囲をバリアント検出のための最適な感度と特異度を達成する（ 図3）を推奨します。この推定値は、プールのサイズとは無関係ですとバリアントの型を検出することができます。必要に応じて複数のレーンとランは、十分なカバレッジを達成するために組み合わせることができます。 3。シーケンスは、アライメントと解析を読み込みます。 ファイルの圧縮とフォーマット：生シークエンスの読み取りファイルのいずれかスカーフ形式または圧縮に変換する必要があります。それは関連するすべての情報を失うことなく、その後の解析ステップの時間と空間を節約して圧縮はオプションです。これは、次のコマンドに含まれているスクリプトRAPGAP_read_compressor_v2.plを使用することによって達成されています。 ./RAPGAP_read_compressor_v2.pl> [圧縮された読み込みファイル] [ファイルを読む] 承認された読み込みファイルの入力形式は、スカーフとFASTQ、gzipで圧縮または非圧縮のいずれかになります。 スカーフ形式の例： HWI-EAS440：7:1:0:316＃0/1：NTCGATTCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCC：DNWUQSPWWWWUVVPVVWVVVUVVUUPUUWWWWWUW FASTQフォーマットの例： @ HWI-EAS440_7_1_0_410＃0/1 NGTGGTTTCTTCTTTGGCTGGGGAGAGGAGCTGGTG + ＆/ 8888888888888888888854588767777666！ 生の読み込み整列：生読み取りは、現在のPCR反応と同様に、陽性および陰性コントロールに含まれている対象地域に固有の注釈付きのFASTA参照配列に整列させることができます。アライメントはRAPGAPHASH5d含ま整列ツールを使用して実行することができます。この時点では、入力フォーマットは、スカーフや圧縮である必要があります。整列のためのコマンドは次のとおりです。 ./RAPGAPHASH5d [圧縮された読み込みファイル] [FASTAファイル] [数の編集を許可]> [ファイルの整列] 参照配列と比較して、許可されている読み取り当たりのミスマッチの数は、ユーザ定義のパラメータです。ミスマッチの過剰な数を持っている読み取りは破棄されます。我々は101 bpの読み込みのためにbpの読み取り76と5の不一致のために36 bpの読み取り、4つのミスマッチ2のミスマッチを可能にすることをお勧めします。それ以上のミスマッチを許可するほかにできるように過剰なシーケンシングエラーの可能性を増加させるignedデータ。リード長が長くなるし続けるにつれて、この値はさらに増加することができます。 同じフローセルからタギング整列ファイル：この時点で全体の整列ファイルの読み取りが同じフローセルから同じシーケンスの実行（すなわち、複数のレーンに属する読み取るファイルを識別するために、一意の識別子（ "タグ"）与えられるべきでは集約できます。と）は、単一のタグが与えられます。各マシンの実行は、タグを経由して特徴づけることができる固有のエラー·プロファイルを生成するためのタグが必要です。タグは、読み取りのセット（アンダースコア文字 "_"の構文解析の問題については、使用すべきではありません）を区別するために使用される文字の英数字文字列です。別のタグが異なるフローセルまたはマシンの実行で生成された整列読み取りファイルを使用する必要があります。タグは、次のコマンドに含まれてRAPGAP_alignment_tagger.plを使用して追加することができます。 。/ RAPGAP_alignment_tagger.pl [アラインファイル] [TAG]> [タグ付きファイルを整列] このポイントの後、整列それぞれのタグがそれらを分けておきますので、複数の異なるフローセルで生成された同じライブラリからのファイルを一緒に組み合わせることができます。 誤差モデルの生成：前述したように、各マシンの実行は正確なバリアントを呼び出すために特徴付けする必要があるシーケンスエラーが発生した固有のプロファイルを生成します。各マシンの実行のためにこれらのエラーをモデル化するために、配列の変化を欠いていることが知られている内部統制のシーケンスは、プールされた各サンプルライブラリに含まれています。整列タグ付きファイルから、エラーのモデルファイルは、ネガティブコントロールのリファレンスシーケンスに含まれているツールEMGENERATOR4を使用して生成することができます。すべての負の制御シーケンスを使用するか、あるいは5 'および3'入力の中で最も塩基によって指定されたそれのサブセットのみ、することができます。ユニークな読み取りとpseudocounts常に使用する必要があります。 ./EMGENERATOR4 [整列タグ付きファイル] [負の制御シーケンス] [出力ファイル名]の中で最も基地[5 '[3使用する負の制御のほとんどの基本]'を[含まれる固有の使用するネガティブコントロールにのみ読み込む？ = Y] [アライメントがカットを編集] [pseudocountsを入力します。？ = Y] EMGENERATOR4ツールは、_0、_1や_2に続いて出力ファイル名をパラメータとして指定された3つのファイルを生成します。これらのファイルはそれぞれ0次、1次と2次誤差モデルに対応しています。SPLINTERで呼び出しバリアントでは、2次誤差モデルは、常に使用する必要があります。 実行時 ​​のエラー率プロファイルを可視化するため、error_model_tabler_v4.plは、0次のエラーモデルファイル（ 図4）上でPDFエラープロットを生成するために使用することができます。 ./error_model_tabler_v4.pl [エラーモデル0次ファイル] [出力ファイル名] プロットファイルは、実行固有のエラーの傾向を明らかにすると、次のセクションで説明されている分析に使用される読み込み拠点の最大数を推測するために使用することができます。 4。 SPLINTERを使用した希少なバリアント型（Variant）の検出 バリアントのcallinSPLINTERによってG：分析の最初のステップは、エラーモデルと参照配列を使用して、整列ファイルでスプリンターツールを実行することです。これを行うにはコマンドは次のとおりです。 ./SPLINTER6r [整列タグ付きファイル] [FASTAファイル] [2次誤差モデルファイル] [の数は使用する基地を読む] [除外される塩基またはサイクルを読む] [P-値のカットオフ= -1.301]ユニーク[使用すると、読み込み= Y] [アライメントがカットを編集]オプションから[プールサイズ] [ストランドごとに絶対的なカバレッジをプリントアウト= Y]> [SPLINTERファイル] 使用する読み込み塩基数は異なり、実行ごとに応じて評価されるべきである。我々は一般的に彼らは最高品質のデータ（最初の24は、たとえば、読み取り36bp長いの塩基を読み取る）を表すように、読み取りの最初の3分の2を使用することをお勧めします。 （コンマまたはN、例えば5,7,11またはNで区切られた）に欠陥が見つかった場合は、単一の読み取り塩基は、分析から除外することができます。 p値のカットオフは、解析を呼び出すバリアントがあるとしているか厳しい決まります。我々もマリー-1.301の最小カットを（log10のスケールで≤0.05、p値に対応する）ことにより、分析を開始します。プール·サイズのオプションは、実際のプール内の単一の対立遺伝子のそれよりも少ないマイナーアレル頻度の潜在的な変異体を排除することにより、 "信号対雑音"差別のアルゴリズムを最適化します。 50個体のプールの例では、最小観測されたバリアントは、0.01周波数または100の対立遺伝子の1で期待することができます。したがって、プール·サイズ·オプション（40人が調査されている場合に最も近いオプションは、100のプールのサイズになるので、我々は、80対立遺伝子を期待してIE）の実験で分析した対立遺伝子の実際の数より大きい最も近い値に設定する必要があります。周波数<0.01で呼び出さバリアントは、ノイズとして無視されます。このファイルには、バリアントの位置の説明については、バリアントの型、DNA鎖当たりのp値は、バリアントの頻度とDNA鎖あたりの総カバレッジ（で、サンプル間で統計的に有意であるすべてのヒットを返します。 <stronG>表2）。 いわゆるバリアントのカバレッジを正規化：サンプル全体の範囲の変動は、スプリアスヒットを生成することができます。これは、次のようにsplinter_filter_v3.plスクリプトを適用することによって修正できます。 ./splinter_filter_v3.pl [スプリンターファイル] [リストファイル] [ジェン]> [SPLINTER正規化されたファイル] リスト·ファイルはタブ区切りファイルの形式で陽性対照ヒットのリストです。 番目のフィールドは、変異が存在している位置を示すのに対し、最初のフィールドは、関心のアンプリコンを示しています。 Nはシーケンスの残りの部分は任意の突然変異が含まれていないことを示しています。 正の制御データを使用して最適なp値のしきい値を決定する：正規化した後、陽性対照の分析は、特定のサンプル分析の感度と特異性を最大にするために不可欠である。これは、情を使用して最適なp値のカットオフを見つけることによって達成することができます陽性対照からる。ほとんどの場合、-1.301の初期のp値はそうだとすれば、正または負のコントロールから偽陽性の呼び出しをもたらすでしょう、十分に厳格ではありません。すべてのスプリンター分析では、 先験的に予測することができませんでした各バリアントと呼ばれる（ 表2の列5と6を参照）のために実際のp値が表示されます。しかし、全体の分析は、既知の真陽性のベース位置の初期出力で表示された少なくとも厳格なp値を使用して繰り返すことができます。これは、ほとんどを排除しながら、すべての真の陽性を保持するのに役立つでしょう、すべてではありませんが、偽陽性および彼らは通常、真の陽性と比較してはるかに少ない重要なp-値を持っています。このプロセスを自動化するには、cutoff_tester.plを使用することができますcutoff_tester.plはスプリンター出力ファイルと正規化に使用されるものとして、タブ区切りファイルの形式で陽性対照ヒットのリストが必要です。 。/ cutoff_tester.pl [スプリンターフィルタEDファイル] [リストファイル] 結果の出力は徐々に（ 表3を参照）最適なものに到達するカットオフ値のリストになります。形式は次のとおりです。 [感度] [特異性] [カット] [最大感度と特異性からの距離] たとえば、次の 7.76946294170104e-07 1 0.999118554429264 -16.1019999999967 最後の行は、実行のための最適なカットオフを表しており、したがって、データ解析に使用することができます。最適な結果は、1の感度と特異度を達成することです。この結果は達していない場合には、 スプリンター分析は、最も最適な条件が達成されるまで、法人の数は拠点を読んで変更することにより、繰り返すことができます。 フィルタリング最後のバリアント：最後のカットでは、最適なカットオフ以下のヒットからスプリンター出力ファイルをフィルタリングしますcutoff_cut.plスクリプトを使用して、データに適用することができます 。/ cutoff_cut.pl [SPLINTERフィルタファイル] [カット]> [SPLINTER最後のファイル] このステップでは、試料中に存在するSNPとindelsのが含まれています最後のスプリンター出力ファイルを生成します。挿入の出力が置換または欠失（ 表2）よりもわずかに異なることに注意してください。 5。代表的な結果我々は、947個体の集団をプールし、そして配列決定のために20キロバイト以上の対象とした。我々は、標準プロトコルを以下のまれな変異体の検出のための破片を適用した。各個人が以前にゲノムワイドなジェノタイピングアレイによって実行されるジェノ持っていた。タグ付きのタイピングとプールしたサンプルで呼び出され、新規変異体の間に一致します（ 図6）優れていた。 3種類の2つ（rs3822343とrs3776110）は、人口では稀であったシークエンシングの結果からのde novoと呼ばれていました、個々のパイロシーケンシングによって検証されています。プール内のマイナーアレル頻度（MAF）は、MAFに類似していた dbSNPのビルド129に報告した。パイロシーケンシングおよびプールされたシーケンスの間にMAFの一致は、（ 表3）優れていた。 陽性コントロールについては、 表1の DNAオリゴヌクレオチド配列。各シーケンスは2つの置換または1つの挿入と1の欠失のいずれかの方法で野生型の基準とは異なるDNA断片で構成されています。 拡大画像を表示するには、ここをクリック 。 表2。スプリンターの出力例を示します。最初の2行は、置換または欠失（青いヘッダ）の標準的なスプリンター出力を表しています。最後の行は、挿入のための標準的なスプリンター出力（紫ヘッダ）を表します。rget = "_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください。 表3。ファイブは知られており、3つの新規変異体は、大規模な集団から識別し、個々の遺伝子型によって検証されています。個々の検証は、パイロシーケンシング（行1-3）は、TaqManアッセイ（行4-6）またはサンガー（行7,8）により行った。対立遺伝子頻度の広い範囲およびプールされたシーケンスアレル頻度の推定と個々の遺伝子型の間にMAF <1％、一致が強かった5つの位置を含む。アスタリスク（*）が付いている位置が以前に報告されたデータ9から構成されている。 図1。プール-DNAシーケンシングとスプリンター分析の概要。患者DNAがプールされと選択した遺伝子座で増幅されます。最終的なPCR産物は、モル比で、正と負の制御と一緒にプールされます。プールされたミックスは、次に塩基配列を決定し、得られた読み取りは、それらの参照にマッピングされています。マップされたネガティブコントロールは、実行固有のエラーモデルを生成するために使用され読み込まれます。スプリンターは、エラーモデルとポジティブコントロールから情報を組み込むことにより、稀SNPとindelsのを検出するために使用することができます。 [Vallania FLM ら、ゲノム研究 、2010年から適応] 拡大画像を表示するには、ここをクリック 。 図2プールのPCRアンプリコンライゲーションと超音波。ライゲーションとライブラリ調製プロトコルのランダム断片化手順のデモンストレーションとして、pUC19ベクターは、酵素的にレーン2に示すように、フラグメントに消化した。これらのフラグメントは、ノーマであった上記1.7のステップに従って、分子の数によってlized組み合わせて、ランダムに連結した。結果として大規模なコンカテマーは、レーン3に示されています。上記の手順1.8で説明したように連結したコンカテマーは、均等に分割し、超音波処理に供した。それぞれの技術的な複製のためのDNA断片の得られた塗抹標本は、レーン4および5に示されています。ブラケットは、ゲル抽出とシーケンシングライブラリの作成に使用されるサイズの範囲をハイライト表示さ​​れます。 図3。プールしたサンプル内の単一の対立遺伝子のカバレッジの関数としての精度。精度は0.5（ランダム）から1.0（完全な精度）の範囲で受信オペレーター曲線（ROC）の曲線下面積（AUC）と推定されています。 AUCは200、500および1000の対立遺伝子（A）のプール内の単一の変異対立遺伝子を検出するための対立遺伝子ごとに範囲の関数としてプロットされています。 AUCは、置換、挿入およびdの関数全体のカバレッジとしてプロットされeletions（B）。 [Vallania FLM ら、ゲノム研究 、2010年から適応。 図4エラープロットは、与えられた位置で、誤った塩基を組み込んだ確率を示しています。エラーのプロファイルは、読み取りシーケンスの3 '末端に向かって増加傾向で低エラーレートを示しています。特に、異なる基準ヌクレオチドが別のエラーの確率を（例えば、参照として与えられたG Cを組み込むことの確率を参照してください）​​が表示されます。 [Vallania FLM ら、ゲノム研究 、2010年から適応。 図5対立遺伝子あたり25倍以上の範囲を持っていたポジションの対立遺伝子頻度を推定する上でスプリンターの精度。パネルA、≥25倍のカバレッジを持つ単一の変異を検出するために最適な感度を示す図3の結果に基づいて非常に高い相関（r = 0.999）でGWAS結果によって測定されアレルカウントでSPLINTERによって推定した、プールされたDNAの対立遺伝子頻度の比較。 [Vallania FLM ら、ゲノム研究 、2010年から適応。 図6。974人のプールされたシーケンスからスプリンターの見積もりに比べGWASで測定した対立遺伝子頻度の比較。比較のための遺伝子型遺伝子と配列領域の間に19共通の立場があった。結果の相関（r = 0.99538）は非常に高くなっています。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。