Utilizzo non fissati, tessuti congelati allo Studio di distribuzione naturale Mucina
Summary
Non fissati campioni di tessuto congelato incorporati nel terreno ottimale temperatura di taglio (OCT) possono essere utilizzati per studiare la distribuzione naturale e glicosilazione di muco secreto. In questa elaborazione tessuto approccio è minimo e la presentazione naturale di glicolipidi, mucine e glicano-epitopi è conservato. Le sezioni di tessuto possono essere analizzati mediante immunoistochimica con rivelatore a fluorescenza o cromogenico.
Abstract
Mucine sono complesse e fortemente glicosilata O-linked glicoproteine, che contengono più del 70% in peso di carboidrati 1-3. Mucine secrete, prodotto dalle cellule caliciformi e della mucosa gastrica, forniscono l'impalcatura per un micrometri di spessore strato di muco che le linee epiteliali dell'intestino e del tratto respiratorio 3,4. Oltre a mucine, strati di muco contengono anche peptidi antimicrobici, citochine, e immunoglobuline 5-9. Lo strato di muco è una parte importante di immunità innata accoglienza, e costituisce la prima linea di difesa contro l'invasione dei microrganismi 8,10-12. Come tale, il muco è soggetto a numerose interazioni con microbi, entrambi i patogeni e simbiotici, e mucine secrete costituiscono un'importante interfaccia per queste interazioni. Lo studio di tali interazioni biologiche di solito comporta metodi istologici per la raccolta dei tessuti e colorazione. I due metodi più comunemente utilizzati per la raccolta dei tessuti istologici e Preservzione nella clinica e nei laboratori di ricerca sono: la fissazione in formalina seguita da paraffina, e il congelamento dei tessuti, seguita da incorporamento nel crio-protectant media.
Incluso in paraffina di campioni di tessuto produrre sezioni con caratteristiche ottimali per la visualizzazione istologica tra cui la chiarezza e ben definita morfologia. Tuttavia, durante il processo di paraffina incorporare un numero di epitopi si alterano e per studiare questi epitopi, sezioni di tessuto devono essere ulteriormente trasformati con uno dei molti metodi smascheramento 13. Mucine secrete e lipidi vengono estratti dal tessuto durante la paraffina-embedding passo di compensazione, che richiede prolungare l'incubazione con solventi organici (xilene o Citrisolv). Pertanto questo approccio è sub-ottimale per studi focalizzati sulla natura e la distribuzione di mucine e muco in vivo.
Al contrario, i tessuti di congelamento a temperature di taglio ottimale (OCT) incorporando un supportovuoti disidratazione e di compensazione del campione, e mantiene l'idratazione del campione. Questo permette una migliore conservazione del muco strato idratato, e consente quindi lo studio dei ruoli numerose mucine in biologia epiteliale. Poiché questo metodo richiede un trattamento minimo del tessuto, il tessuto viene mantenuto in uno stato più naturale. Pertanto sezioni congelate tessuti non richiedono alcuna ulteriore elaborazione prima della colorazione e può essere facilmente analizzati utilizzando metodi di immunoistochimica.
Dimostriamo la conservazione di micrometri di spessore strato di muco secreto in campioni congelati colon. Questo strato viene drasticamente ridotta quando i tessuti stessi sono inclusi in paraffina. Abbiamo anche mostrare una colorazione immunofluorescenza di epitopi glycan presenti in mucine con lectine vegetali. Il vantaggio di questo approccio è che non richiede l'uso di fissativi speciali e permette con tessuti congelati che possono già essere conservati in laboratorio.
Protocol
Discussion
Conservazione di epitopi muco e glicano in tessuti congelati è superiore a quella dei tessuti che sono stati incorporati in paraffina. Abbiamo dimostrato la conservazione di strato di muco secreto (figure 1 e 3) e la distribuzione di tre strutture glicani (Figura 3) in tessuti congelati rispetto paraffinati tessuti. Fissativi specializzati, come soluzione di Carnoy (60% etanolo, 30% cloroformio, acido acetico 10%) 17 sono stati sviluppati per la conservazione ottimale dello strato di muco in campioni di tessuto. In modo ottimale, la soluzione dovrebbe essere utilizzato per raccogliere campioni di tessuto che sono dedicati per studi muco e ha dimostrato di mantenere l'aspetto liscio strato di muco 16-17. Lo strato di muco non fissate in campioni congelati in OCT incorporato appare robusto e in alcune zone possono staccarsi dal tessuto, tuttavia lo spessore complessivo è in accordo con quello osservato nei tessuti che sono stati risolti con la soluzione di Carnoy e embedded in paraffina 16-17. Ad esempio, lo strato di muco congelate in sezione di tessuto umano del colon è ~ 100 um (Figura 1), che è all'interno dell'intervallo riportato per Carnoy's-campionamento fissa colon umano 55,4 ± 2,5 micron (range 7,7-204,8 micron) 16.
E 'noto da decenni che risultati disidratazione in etanolo ~ restringimento 30% dei campioni biologici 18, e che i solventi organici come xilene, Citrisolv e cloroformio lipidi, glicolipidi e, in qualche misura, proteine dai tessuti 13. Trasformazione dei tessuti per la paraffina comprende le seguenti fasi: fissazione (formalina tamponata al 10%), disidratazione (concentrazione di etanolo in aumento), e di compensazione (Citrisolv o xilene). Imitando questi passaggi non fissata sul sezioni di tessuto congelato, abbiamo dimostrato che Citrisolv estrae muco sezioni di tessuto congelato conseguente morfologia tissutale che è simile a quella di tessuti inclusi in paraffina (Figure 2, pannello di destra). Al contrario, lo strato di muco non è stato alterato mediante incubazione con formalina o etanolo (Figura 2, sinistra e pannelli centrali). Questo suggerisce che la fase di compensazione procedura standard paraffina, che richiede incubazione prolungata in Citrisolv / xilene, porta a collasso dello strato di muco. Fissazione in formalina non danneggia lo strato di muco e congelati sezioni tessuti che sono stati fissati in formalina può essere facilmente trattata con lectine e anticorpi contro glicani, glicolipidi e proteine (figure 2, 3 e 6). Questi effetti possono essere trascurabile per lo studio delle proteine di membrana e patologia dei tessuti, ma sono devastanti per strutture altamente idratati come lo strato di muco secreto. Tuttavia studi istologici di mucine sono ancora condotte principalmente con campioni inclusi in paraffina, in cui la conservazione strato di muco è subottimale. Nelle analisi approfondite di composizione dello strato di muco, come la precisa identità di sécreted o membrana combinazioni legate glicoproteina MUC richiedono anticorpi specifici e la spettrometria di massa per l'identificazione delle proteine dorsali. Preservazione dello strato di muco, ma è il requisito iniziale per tali studi.
Molti laboratori hanno campioni di tessuti congelati in OCT che sono stati raccolti in passato per progetti diversi, questi tessuti possono essere facilmente utilizzato per studiare mucine, glicolipidi e distribuzione glicano eliminando la necessità di raccogliere tessuti in fissativi speciali che sono progettati unicamente per la conservazione muco. I tessuti congelati sottoposti a trattamento minimo e quindi la distribuzione naturale dei glicani, che sono idratati in natura, è conservata. Questo è particolarmente importante nel regno di interazioni ospite-microbica. La conoscenza della distribuzione naturalistica e l'abbondanza di mucine secrete e le strutture glycan molti decorare questi "barriera" molecole sarà la chiave per comprendere difesa ospite, lo sfruttamento microbica e patogeniè.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Nicole M. Nemeth (Università della Georgia) e Jeanne M. Fair (LANL) per il loro aiuto nella raccolta tessuti di pollo, e Steven A. Springer per il suo aiuto durante le riprese. La cura di tutti gli uccelli in questo studio era in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute per l'uso umano degli animali da laboratorio e tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso il Los Alamos National Security LLC, operatore del Los Alamos Laboratorio Nazionale nell'ambito del contratto n ° DE-AC52-06NA25396 con il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti. La cura dei topi in questo studio è conforme al protocollo UCSD animale approvato. I tessuti umani sono stati ottenuti come parte del protocollo UCSD IRB approvato. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione 118645 presso la University of California Programma Fee Lab Presidente (PG) e la concessione NS047101 dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke (Fondo Microscopia Neuroscienze in comune, UC San Diego).
Materials
| Name of reagent and equipment | Company | Catalogue number |
| 2-methyl butane | Fisher Scientific | 03551-4 |
| AEC peroxidase substrate kit | Vector Labs | SK-4200 |
| Alcian Blue | Sigma-Aldrich | A3157 |
| Anti-CA 19-9 monoclonal antibody | Calbiochem | CA1003 |
| Anti-MUC5AC monoclonal antibody | Millipore | MAB2011 |
| Avidin-Biotin blocking kit | Vector Labs | SP-2001 |
| Biotinylated donkey anti-mouse antibody | Jackson Immunoresearch | 90863 |
| Biotinylated SNA | Vector Labs | B-1305 |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 |
| Chitin-hydrolysate | Vector Labs | SP-0090 |
| Cryostat microtome | Leica Microsystems | Leica CM 1800 |
| Hematoxylin | Surgipath Medical Ind. | 3801570 |
| Hydrogen peroxide 30% | Fisher Scientific | H325-100 |
| Jacalin-FITC | Vector Labs | FL-1151 |
| Mayer’s Hematoxylin | Sigma-Aldrich | MHS32 |
| Melibiose | Sigma-Aldrich | M5500 |
| Nuclear Fast Red | Vector Labs | H-3403 |
| OCT compound | VWR International | 25608-930 |
| Peroxidase conjugated streptavidin | Jackson Immunoresearch | 94638 |
| Schiff reagent | Electron microscopy sciences | 26052 |
| sWGA-Rhodamine | Vector Labs | RL1022S |
| TKH2 monoclonal antibody | ATCC | HB-9654 |
| VectaMount aqueous mounting media | Vector Labs | H-5501 |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 |
| Peel-A Way molds | Polysciences Inc. | 18646A-1 |
References
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