Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot

Lipopolissacarídeo (LPS) é um componente importante da bacteriana gram-negativa membranas externas. É uma molécula tripartido consistindo de lípido A, que é incorporado na membrana externa, um núcleo de oligossacáridos e repetindo O-antigénio unidades que se estendem para fora a partir da superfície da célula ^{1, 2.} LPS é uma molécula imunodominante que é importante para a virulência e patogénese de muitas espécies bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, espécies de Salmonella e Escherichia coli ^3-5, e as diferenças na forma de composição LPS O-antigénio a base para serotipagem de estirpes. LPS está envolvido na ligação a células hospedeiras no momento do início da infecção e fornece protecção contra a morte mediada pelo complemento; estirpes que carecem de LPS pode ser atenuado para a virulência ^6-8. Por estas razões, é importante para a visualização de LPS, particularmente a partir de isolados clínicos. LPS Visualizing bandas padrões e reconhecimento por um específicontibodies podem ser ferramentas úteis para identificar linhagens de deformação e caracterizar vários mutantes.

Neste relatório, nós descrevemos um método aquosa-fenol quente para o isolamento e purificação de LPS de bactérias Gram-negativas células bacterianas. Este protocolo permite a extracção de LPS de distância a partir de ácidos nucleicos e proteínas que podem interferir com a visualização do LPS, que ocorre com mais curtos, métodos de extracção menos intensivos ^9. LPS preparados desta maneira podem ser separados por dodecilsulfato de sódio (SDS)-poliacrilamida electroforese em gel (PAGE) e directamente corado usando hidrato de carbono / glicoproteína manchas ou métodos de coloração padrão de prata. Muitos anti-soros para LPS conter anticorpos que reagem de forma cruzada com as proteínas da membrana externa ou alvos antigénicos outros que podem dificultar a reactividade observados após immunoblot ocidental de SDS-PAGE separados lisados ​​celulares brutos. Tratamento com protease de lisados ​​celulares brutos por si só não é sempre uma forma eficaz de remoção destafundo de usar este ou outros métodos de visualização. Além disso, o tratamento da protease extensa, numa tentativa de remover este pano de fundo pode levar a LPS de baixa qualidade que não é bem resolvidos por qualquer um dos métodos acima mencionados. Por estas razões, acreditamos que o protocolo seguinte, adaptado de Westpahl e Jann ^10, é ideal para a extracção de LPS.