Engenharia e Evolução da Synthetic vírus adeno-associado (AAV) Gene vetores de terapia através de DNA Família Shuffling

Virais adeno-associados (AAV) vectores representam alguns dos veículos mais potentes e promissora para a transferência de gene terapêutico humano devido a uma combinação única de propriedades benéficas ^1. Estes incluem o apathogenicity dos vírus tipo selvagem subjacentes e as metodologias altamente avançadas para a produção de título elevado, de elevada pureza e grau clínico vectores recombinantes ^2. Uma outra vantagem particular do sistema de AAV sobre outros vírus é a disponibilidade de uma variedade de ocorrência natural serotipos que diferem em propriedades essenciais ainda podem ser facilmente concebido como vectores utilizando um protocolo comum ^1,2. Além disso, um número de grupos incluindo o nosso próprio recentemente desenvolvido estratégias para usar estes vírus naturais como modelos para a criação de vectores sintéticos que ou se combinam os activos de serotipos de entrada múltiplas, ou que melhoram as propriedades de um único isolado. As respectivas tecnologias para alcançar essas metas are ambas as famílias de DNA baralhar ^3, isto é, a fragmentação de vários genes de AAV cápside, seguida da sua re-montagem com base em homologias parciais (tipicamente> 80% para a maioria dos serotipos de AAV), ou de exibição de péptidos ^4,5, inserção ou seja, de geralmente sete aminoácidos na um circuito exposta da cápside viral em que o peptídeo idealmente medeia re-direccionamento para um tipo de célula desejado. Para o máximo sucesso, ambos os métodos são aplicados de uma forma de alto rendimento em que os protocolos são-up escalado para produzir bibliotecas de cerca de um milhão distintas variantes do capsídeo. Cada clone é então constituído por uma combinação única de numerosos vírus parentais (ADN abordagem baralhar) é ou contém um péptido distintivo dentro da espinha dorsal mesmo viral (abordagem de exibição de péptidos). O passo final subsequente é iterativo selecção de uma biblioteca em células alvo, a fim de enriquecer para cápsides individuais que preenchem mais ou, idealmente, todos os requisitos do processo de selecção. O último de preferência penteines pressão positiva, como o crescimento de um tipo de célula certa de interesse, com seleção negativa, para a eliminação exemplo de todos os capsídeos reagem com anticorpos anti-AAV. Esta combinação aumenta a probabilidade de que cápsides sintéticos sobreviventes a selecção correspondem às necessidades da aplicação dada de uma forma que, provavelmente, não têm sido encontrados em qualquer AAV que ocorre naturalmente isolar. Aqui, vamos nos concentrar no método DNA família baralhar como teórica e experimentalmente mais desafiador das duas tecnologias. Descrevemos e demonstrar todas as etapas essenciais para a geração e seleção de bibliotecas embaralhadas AAV (Fig. 1), e depois discutir as armadilhas e os aspectos críticos dos protocolos de que é preciso estar ciente, a fim de ter sucesso com a evolução molecular de AAV.