Ingegneria ed evoluzione del sintetico virus adeno-associato (AAV) Vettori Terapia genica attraverso la famiglia Shuffling DNA

Virali adeno-associati (AAV) vettori rappresentano alcuni dei veicoli più potenti e promettenti per il trasferimento del gene terapeutico umano a causa di una combinazione unica di proprietà benefiche ^1. Questi includono la apathogenicity dei virus di tipo selvatico sottostanti e le metodologie più avanzate per la produzione di alta titolo di elevata purezza e vettori ricombinanti clinico-grado ^2. Un ulteriore vantaggio particolare del sistema di AAV su altri virus è la disponibilità di una ricchezza di natura sierotipi che differiscono nelle proprietà essenziali ancora possono essere facilmente costruiti come vettori usando un protocollo comune ^1,2. Inoltre, una serie di gruppi tra cui il nostro ha recentemente messo a punto le strategie per utilizzare questi virus naturali come modelli per la creazione di vettori sintetici, che combinano sia i beni di sierotipi di input, o che esaltano le proprietà di un singolo isolato. Le rispettive tecnologie per raggiungere questi obiettivi are sia DNA shuffling famiglia ^3, ossia la frammentazione di vari geni del capside di AAV seguita dalla loro rimontaggio basato su omologie parziali (tipicamente> 80% per la maggior parte sierotipi di AAV), o visualizzare peptide ^4,5, inserimento cioè di solito in sette aminoacidi un ciclo esposta del capside virale in cui il peptide idealmente media ri-targeting per un tipo cellulare desiderato. Per il massimo successo, entrambi i metodi sono applicati in un high-throughput di moda in cui i protocolli sono up-scalati per produrre librerie di circa un milione di varianti distinte del capside. Ciascun clone è quindi composto da una combinazione unica di numerosi virus parentale (DNA shuffling approccio) o contiene un peptide distintivo all'interno della stessa dorsale virale (approccio visualizzazione peptide). Il successivo passo finale è iterativa selezione di tale libreria sulle cellule bersaglio, al fine di arricchire per capsidi individuali che soddisfano la maggior parte o idealmente tutti i requisiti del processo di selezione. Quest'ultimo preferibilmente pettineines pressione positiva, come la crescita su un tipo di cellula certo interesse, con la selezione negativa, per esempio, l'eliminazione di tutti i capsidi che reagiscono con gli anticorpi anti-AAV. Questa combinazione aumenta la probabilità che capsidi sintetici sopravvissuti alla selezione corrispondono alle esigenze del data applicazione in un modo che probabilmente non sono stati trovati in ogni naturale AAV isolare. Qui, ci concentriamo sul metodo famiglia DNA shuffling come teoricamente e sperimentalmente più impegnativo delle due tecnologie. Descriviamo e dimostrare tutti i passi essenziali per la generazione e la selezione di librerie mischiate AAV (Fig. 1), e poi discutere le insidie ​​e gli aspetti critici dei protocolli che bisogna essere a conoscenza al fine di avere successo con l'evoluzione molecolare AAV.