Engineering en Evolutie van synthetische adeno-geassocieerd virus (AAV) gentherapievectoren via DNA Family Shuffling

Adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren zijn enkele van de meest krachtige en veelbelovende voertuigen voor therapeutische menselijke gen-overdracht als gevolg van een unieke combinatie van gunstige ^{eigenschappen: 1.} Deze omvatten de apathogenicity van de onderliggende wild-type virussen en de zeer geavanceerde methoden voor de productie van high-titer, hoge zuiverheid en klinisch-grade recombinante vectoren ^2. Een ander bijzonder voordeel van de AAV-systeem ten opzichte van andere virussen is de beschikbaarheid van een schat van natuurlijk voorkomende serotypen die verschillen in essentiële eigenschappen nog kunnen allemaal gemakkelijk worden gemanipuleerd als vectoren met behulp van een gemeenschappelijk protocol ^1,2. Bovendien hebben een aantal groepen met inbegrip van onze eigen onlangs bedacht strategieën om deze natuurlijke virussen gebruiken als sjablonen voor het maken van synthetische vectoren die ofwel een combinatie van de activa van multiple input serotypen, of die verbetering van de eigenschappen van een enkele isoleren. De respectieve technologieën om deze doelen te bereiken are ofwel DNA-familie schudden ^3, dat wil zeggen de versnippering van de verschillende AAV capside genen gevolgd door hun re-assemblage gebaseerd op gedeeltelijke homologieën (meestal> 80% voor de meeste AAV serotypes), of peptide-display ^4,5, dat wil zeggen het inbrengen van meestal zeven aminozuren in een blootgestelde lus van het virale capside waarbij het peptide voorkeur medieert opnieuw richten een gewenste celtype. Voor een maximaal resultaat zijn beide methoden toegepast in een hoge-doorvoer wijze waarbij de protocollen opgeschaald bibliotheken van ongeveer een miljoen verschillende capside varianten opleveren. Elke kloon wordt dan uit een unieke combinatie van vele virussen ouderlijke (DNA-shuffelen benadering) of bevat een karakteristieke peptide in dezelfde virale ruggengraat (peptide elkaar benadering). De daaropvolgende laatste stap is iteratief selectie van een dergelijke bibliotheek op doelcellen om te verrijken voor individuele capsiden vervullen van de meeste of idealiter aan alle eisen van het selectieproces. De laatste bij voorkeur kamines overdruk, zoals groei op een bepaald celtype van belang met negatieve selectie bijvoorbeeld verwijdering van alle capsiden reageren met anti-AAV antilichamen. Deze combinatie verhoogt de kans dat de synthetische capsiden het overleven van de selectie van de behoeften van de specifieke toepassing op een manier die waarschijnlijk niet zou zijn in een van nature voorkomende AAV isoleren evenaren. Hier richten we ons op de DNA-familie shuffelwerkwijze als het theoretisch en experimenteel grotere uitdaging van de twee technologieën. We beschrijven en demonstreren van alle essentiële stappen voor het genereren en selectie van geschud AAV bibliotheken (afb. 1), en dan bespreken de valkuilen en kritische aspecten van de protocollen die men moet zich bewust zijn van om te slagen met moleculaire AAV evolutie.