Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

1. Enzymatische Deglykosylierung Verwenden PCR-Röhrchen, um den Wasserverlust durch Verdunstung zu minimieren. Beschriften Sie ein Set von Röhren 1 bis 7. Auftauen 10X G7-Puffer, der 10X-Glykoprotein denaturierenden Puffer, und die 10% NP-40 und klopfen Sie leicht die Rohre, um den Inhalt zu mischen. Halten Sie bei Raumtemperatur. Legen Sie die enzymhaltigen Fläschchen auf dem Eis. Versuchen Sie zum Auftauen / Einfrieren-Zyklen zu minimieren. Lösen Sie den Inhalt des hCGβ Fläschchen (150 ug) in 600 ul dH 2 O und halten auf dem Eis. Bereiten Sie 1 ml 1X G7-Puffer durch Verdünnen des 10fach in dH 2 O. Verdünnen 0,5 ul PNGase F in 25 ul 1X G7-Puffer und halten auf dem Eis. Bereiten Sie die exoglycosidase Mix (EG-Mix) durch die Kombination von 2 ul jedem α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 Galactosidase und α1-3, 6 Galactosidase. Set up PCR-Röhrchen wie angegeben: ak "> Tube / Probe # 1 2 3 4 5 6 7 hCGβ (0.25mg/ml) 9μl 9μl 9μl 9μl – – – 10X Glycoprotein Denaturierungspuffer 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl dH 2 O – – – – 9μl 9μl 9μl Verschließen Sie die Röhrchen, vorsichtig mischen und in dieThermocycler, schließen Sie den Deckel und Denaturierung der Proteine ​​durch Inkubation 10 Minuten bei 94 ° C, mit einem 4 ° C zu halten, gefolgt (mit PCR-Röhrchen in einem Thermocycler stark verhindert die Verdunstung in kleinen Proben). Entfernen Sie die Schläuche aus Thermocycler und Zentrifuge zu keiner sichtbaren Kondensation zu entfernen. Fügen Sie die folgenden Reagenzien wie angegeben: Sample # 1 2 3 4 5 6 7 10% NP-40 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 10X G7 Buffer 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5 & mu; L 2.5μl PNGase F 01.50 dil. – 2μl – – 2μl – – Deglykosylierung Mix – – 2μl 2μl – 2μl 2μl EG-Mix – – – 2μl – – 2μl dH 2 O 10 &mgr; l 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl Insgesamt Reaktion vol. 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l </ Td> 25 μ l 25 μ l 25 μ l Schließen Sie die PCR-Röhrchen mit neuen Kappen (verwerfen die benutzten, da sie nicht richtig passen nach einer Inkubationszeit Zyklus). Mischen Sie die Röhrchen durch leichtes Antippen 4 mal und dann drehen Sie den Inhalt nach unten. Die Röhrchen in den Thermocycler und bei 37 ° C für 4 Stunden, dann kühlen die Proben auf 4 ° C. 2. SDS-PAGE von Proben deglykosylierter Bereiten Sie 130 ul frisch 3X reduzierenden SDS-Ladepuffer durch Zugabe von 4 pl 1,25 M DTT. Add 12,5 ul der vorbereiteten 3X reduzierenden SDS-Ladepuffer zu jeder Probe. Schließen Sie die Rohre mit neuen Kappen und klopfen Sie leicht die Rohre zu mischen. Die Röhrchen in einem Thermocycler bei 94 ° C für 5 Minuten und dann abkühlen auf 4 ° C. Legen Sie 30 ul jeder Probe und 10 ul der Protein-Marker auf einem 10-20% Tris-Glycin-Gel. Save the Rest der Probe für einen Teil 3.1. Legen Sie 10 &mgr; l der ColorPlus Markers. Elektrophorese des Gels bei 130 Volt bei Raumtemperatur bis der Farbstoff Front ist nahe der Unterseite des Gels. Wenn das Gel beendet ist, entfernen Sie das Gel von der Besetzung und legen Sie sie in eine kleine Plastikbox mit genug Coomasie Bläue, um das Gel zu decken. Stain das Gel für 1 Stunde unter leichtem Schütteln. Wash Gel dreimal für 30 Minuten in 50 ml entfärben Lösung. Notieren Sie sich die Bilder mit einer Weißlicht-Transilluminator oder Scanner. Alternativ kann das Gel zwischen den Blättern der Zellophan in einem Rahmen getrocknet werden. 3. Pro-Q Smaragd 300 für Erkennung von glykosylierten Proteinen in SDS-PAGE-Gelen Parallel mit dem Gel in 2,1), laden den Rest der Proben auf einem 10-20% Tris-Glycin-Gel. Laden 10 & mu; L ColorPlus Markers. Während das Gel läuft lösen die Pro-Q Smaragd Reagenz mit DMF und bereiten die Lager Fix, Wash-und Oxidationsmittel-Lösungen für die Pro-Q Smaragd 300 nach dem Produkt-Handbuch mit dem Kit mitgeliefert Fleck. Wenn die Elektrophorese beendet ist, entfernen Sie das Gel gegossen und legen Sie sie in einer Kunststoff-Box. Fix das Gel durch Zugabe von 100 ml der Fix-Lösung und lassen es über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln. Wash das Gel mit 100 ml der Waschlösung für 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur mit gentile Agitation. Wiederholen Sie die Wäsche mit frischer Waschlösung. Oxidieren die Kohlenhydrate durch Inkubation des Gels mit leichtem Schütteln für 30 Minuten in 25 ml oxidierende Lösung. Wash Gel wie in Schritt 3.5 beschrieben. Während das Gel Waschen vorbereiten frischen Pro-Q Smaragd 300 Flecken durch Zugabe von 500 ul des Pro-Q Smaragd 300 Reagenzlösung in Schritt 3,2 bis 25 ml des gelöstenFärbepuffer im Kit enthalten. Stain das Gel durch Zugabe von 25 ml des Flecks in Schritt 3,8 vorbereitet und Inkubation im Dunkeln unter leichtem Schütteln für 90 bis 120 Minuten. Wiederholen Sie die beiden Waschschritte in Schritt 3.5 beschrieben. Notieren Sie sich die Bilder mit einem UV-Transilluminator bei 300 nm. Verwenden Sie das 80 kDa-Marker, die mit Pro-Q Emerald Green gekennzeichnet ist, die UV-Bild auf ein weißes Licht Bild des Gels zeigt die prestained Leiter überlappen. Vergleichen Sie die Bilder der Coomasie gefärbten Gel in Schritt 2.10 In der Pro-Q Smaragd gefärbtes Gel aus Schritt 3.11. 4. Repräsentative Ergebnisse Die Änderungen im Protein Migration nach enzymatischer Deglykosylierung sind in Abbildung 2 dargestellt. Vergleichen Sie die Kontrollprobe (Panel A, Spur 1) mit dem PNGase F Behandlung (Entfernung der N-Glykane, Spur 2) und Deglycosylierung Mix (PNGase F; sowie Endo-und Exoglycosidasen zu O-Glykane zu entfernen, Spur 3). Keine weitere Reduktionin der Größe wird nach Verdauung mit zusätzlichen Glycosidasen (Bahn 4) zu sehen. Neben einer Veränderung in der Masse, werden Bänder schärfer als Glykane entfernt werden. Eine Band, die unter dem 17 kDa-Marker (Stern) steht für die vollständig deglykosylierter hCGβ Polypeptid (MW: 16 kDa). Andere Bands können von unvollständigen Deglykosylierung oder aus dem mehrere nicht identifizierte Proteine ​​in der hCGβ Probe (siehe Spur 1) ableiten. Lanes 5 bis 7 (Kontrollen) zeigen die Banden auf, die Glycosidasen. Das Glykoprotein-Färbung von Emerald Green ist in Feld B gezeigt Dieses Reagenz oxidiert und Flecken aller Glykane in ein Eiweißmolekül. Daher ist die Intensität des Signals nimmt mit hCGβ enzymatisch deglykosylierter ist (Spur 1 bis Spur 4). Das Restsignal in Bahnen 3 und 4 zeigen das Vorhandensein von Glykan Motive, die resistent gegen die eingesetzten Enzyme werden. Die zusätzlichen Glycosidasen in Spur 4 verwendet entfernen ein paar zusätzliche Zuckerreste: das Protein Migration ist die gleiche, abereinen leichten Rückgang in der Intensität der Färbung zu erkennen. Beständig Zuckereinheiten wurden nicht in allen Protein-Spezies: einige Bands wurden von Emerald Green (abwesend in die UV-Bild, in Klammern) nachgewiesen, was auf sie ausgiebig waren deglykosylierter. Zusätzliche Daten unterstützen die Schlussfolgerung, dass hCGβ heterogen glykosyliert ist. Die untere Bande auf Bahn 2 (Pfeil) ist schwach auf der Emerald Green Bild, während das obere Band auf Spur 2 ist hell, was darauf hinweist, dass viele Glykane Gruppen noch vorhanden sind. Diese Daten unterstützen die Schlussfolgerung, dass rekombinante hCGβ in Maus-Zellen exprimiert mehrere glycoforms enthält 9. Diese unterschiedlichen glycoforms sind aufgrund der inhärenten Heterogenität der Glykosylierung, wo einige Polypeptide nicht erhalten, ein Glykan in jedem Konsens vor Ort und / oder einige Glykane sind erweitert, während andere sogar auf das gleiche Protein nicht. Abbildung 1.Typische Glykosylierungsmustern für sezernierte oder Zelloberflächen-Glykoproteine. Abbildung 2. SDS-PAGE-Gele zeigen enzymatische Deglykosylierung hCGβ. Panel A zeigt ein Coomassie-Blau-Färbung, während Panel B zeigt die Ergebnisse der Pro-Q Smaragd 300 für Visualisierung von glykosylierten Proteinen. Beispiel: 1, hCGβ Kontrolle; 2, PNGase F Verdauung; 3, Deglycosylierung Mix Verdauung; 4, Deglycosylierung Mix plus Exoglycosidasen Verdauung, Proben 5 bis 7 sind die Reagenzien Kontrollen (O-Glyc, O-Glycosidase, GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Gal / Fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase und α1-2 Fucosidase; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase; Neu, Neuraminidase; PNGase; PNGase F)