Métodos de auto-administração intravenosa em um modelo de camundongo

1. Animais Procedimentos Habitação e aclimatação Macho e fêmea CD-1 ratos são alojados com pessoas do mesmo sexo ninhada, até 5 animais por gaiola, em gaiolas padrão de plástico contendo cama de chip beta e almofadas nestlet, com tampas de grade de arame para acomodar garrafas de água e alimentos. Padrão para murinos e água estão disponíveis ad libitum nas gaiolas casa durante todo o experimento. Ratos são mantidos em um cronograma claro-escuro reverso (luzes acesas 22:00-10:00). Ratos são permitidos aclimatizar às salas de teste IVSA durante uma semana antes do início dos procedimentos experimentais. 2. Formação operante Todos os procedimentos de comportamento, incluindo a formação de leite adoçado e drogas intravenosas de auto-administração sessões são realizadas com câmaras operantes de medição 15,9 x 14 x 12,7 cm, equipados com duas alavancas de ultra-sensíveis do rato, copos dipper, luzes de estímulo e bombas de seringa (microlitro Med Assocates Inc., St. Albans, VT, EUA). Câmaras são interligados a um computador usando Med Associates inteligente CR interface e Med-PC software para programar o esquema de reforço e coletar dados. Ratinhos naive estão habituados às câmaras operantes e treinados para pressionar a alavanca usando uma recompensa de leite adoçado (0,1 ml) apresentada num copo dipper. Formação leite operante é conduzido em 1-hr sessões durante 5-7 dias. A conclusão de um rácio fixo cronograma (FR) sobre a alavanca activa resulta na apresentação do copo dipper e a iluminação de uma luz de estímulo. A solução de leite adoçado consistiu de sacarose (10 mg / ml, o reagente ACS, Sigma-Aldrich Inc. St. Louis, MO, EUA), adicionado ao leite gordo (3,25% de teor de gordura). Formação operante com uma solução de leite adoçado ou um reforçador alimento líquido é uma técnica comum utilizada para facilitar a responder operante em 1,2 ratinhos. 3. Preparação do equipamento a ser utilizado durante a cirurgia Requequipamentos IRED – 20, 23 e 26 agulhas de calibre, moedor, um cc seringas, tubos de tygon, ferro de solda, heparina, antibióticos e analgésicos. Prepara-se uma agulha para guiar a inserção do cateter na veia jugular raspando para baixo uma agulha de calibre 20. O corpo da agulha é raspada para baixo, usando um moinho de modo a formar um canal no interior da agulha para guiar o tubo do cateter dentro da veia. O canal de agulha deve ser cuidadosamente controlado para todos os restos de metal que pode ter sido depositado. Quaisquer obstruções para o canal deve ser raspado com uma pinça ponta fina. Adaptar dois 1-cc seringas para serem utilizados para a lavagem e a verificação do cateter. Prepare duas seringas, tendo 12 peças centímetros de tubo Tygon e anexá-las em uma extremidade a 26 agulhas de calibre afixados seringas de 1 cc, e esticar as outras extremidades do tubo de mais de 23 agulhas de calibre. Uma seringa deve ser preenchido com 0,9% de solução salina estéril e a outra com uma solução de ticarcilina heparinizado (33 mg de ticarcilinae 0,3 mg de heparina por 10 ml de solução salina estéril). Preparar tampões de cateter cânula. Tubagem Tygon é esticada sobre uma agulha de calibre 23, e de reduzir a 1 cm do bisel. Derreter a extremidade aberta do tubo para criar uma vedação de espessura. A tubagem deve ser fundida de modo que a tampa da cânula inteiro é suficientemente longo para se ajustar sobre a cânula do cateter, com o encaixe final selado firmemente sobre a extremidade da cânula. Observe que, se a tampa estiver demasiado tempo, há um risco de que ela vai ser dobrada e subsequentemente perfurado durante o processo de fixação do parafuso no cateter cobre. Assim, uma preparação cuidadosa das tampas do cateter é recomendado, a fim de proporcionar um bom ajuste para a cânula. Preparar soluções necessárias. Todos os reagentes são adquiridos de Sigma-Aldrich Inc. (St-Louis MO, EUA). Ticarcilina solução heparinizada para a lavagem do cateter – Dissolver 0,33 g de ticarcilina (sal dissódico) e 0,003 g de heparina em 10 ml de solução salina estéril. 0,03 ml de solução é lavada through cateter diária. A solução antibiótico é administrado para prevenir coágulos sanguíneos e infecções de desenvolvimento. Amikicin (antibiótico) para injecção subcutânea – Uma única injecção subcutânea é dada após a cirurgia, numa dose de 10 mg / kg para prevenir infecções pós-operatórias. O cetoprofeno (analgésico) para injecção subcutânea – Uma única injecção subcutânea é dada após a cirurgia, numa dose de 5 mg / kg para administrar qualquer dor no pós-operatório. 4. Cirurgia de implante de cateter Equipamento necessário e reagentes: solução salina, estéril, isoflurano, o álcool (70%), 1 e 3 seringas cc cheio com solução salina estéril, 1 cc-seringas adaptadas, soluções de antibióticos e analgésicos preparados na secção 3 acima, os cateteres de rato (CamCaths, Cambridgeshire, UK ), capas de cateter (tampas de cristal do HRS científicos, Montreal, Quebec), lubrificante ocular, 4 cm de barras de plástico para elevar veia (estapode ser construído a partir de um plástico Q-tip), Polysporin, compressas estéreis e gaze, pinça de curvas e retas, braçadeiras da artéria, tesoura fina. Utilizando técnicas assépticas padrão a bancada cirúrgica, os instrumentos cirúrgicos e os cateteres são esterilizados antes da cirurgia. Técnicas de esterilização apropriadas incluem o vapor em autoclave, para os instrumentos cirúrgicos e cateteres comprados CamCaths. Contas de vidro a esterilização também pode ser usado na ponta dos instrumentos cirúrgicos. De esterilização por óxido de etileno pode ser utilizado nos cateteres mais delicados ou materiais que derretimento risco. Uma descrição mais detalhada das técnicas de assepsia roedor cirúrgicos podem ser encontrados em referências a 1,2 em anexo. Definir-se do banco, instrumentos e cone do nariz para a manutenção da anestesia é ilustrado na foto. Os ratos são anestesiados com isoflurano a gás, e mantidos sob anestesia, utilizando um tubo de respiração sob um sistema de eliminação. Lubrificante ocular (Lágrimas Naturale PM) é aplicada a ambos os olhos, para evitar que sequem durante o procedimento. Uma margem adequada cirúrgico é raspado na parte de trás do animal e em volta do pescoço. Antes de qualquer incisões são feitas, os campos cirúrgicos são restritas usando campos estéreis. A fim de preparar o cateter para inserção no interior do átrio direito do coração, o tubo do cateter é cortado excesso 1,2 centímetros a partir do bolbo do cateter. Este é o comprimento óptimo estabelecido para adultos ratinhos CD-1, de cerca de 8 semanas de idade, 20-25 gramas de peso do corpo. O comprimento do tubo do cateter pode ser necessário ajustar ligeiramente (por tentativa e erro), a partir da estirpe, tamanho e idade dos ratos. Antes da inserção, a seringa contendo solução salina estéril (secção 3.2) está ligado à cânula do cateter, e o cateter é lavada e verificada a existência de fugas. Manteresta seringa ligada ao cateter durante todo o procedimento cirúrgico. Será usado para lavar o cateter, e tirar o sangue de volta no passo 4.7. Após a esterilização com álcool a 70%, de 2cm de longa incisão é feita midscapular partida a meio caminho na parte de trás e terminando abaixo do gargalo, a fim de acomodar a base do cateter. Tecido conjuntivo devem ser forçados a se separar com uma pinça para dar espaço para a base de cateter abaixo da pele. Colocar o animal em suas costas, um raso segunda 1-2 cm na diagonal incisão é feita a partir da clavícula direita indo para cima no queixo animais, depois que a área foi limpo com álcool a 70%. A veia jugular vai ser encontrado superficialmente sob a pele do pescoço. Na preparação para a inserção do catéter, tubagem a partir da base do cateter é puxado através da incisão no dorso e trazido para perto da veia jugular, passando o tubo sob a pele apenas sobre o ombro direito. A extremidade do tubo do cateter éem seguida, ligado a um grampo de artéria e colocado no lado do animal, para o manter no lugar. A veia jugular direita é localizado por gentilmente afastando conjuntivo superficial e tecido adiposo a partir da incisão em volta do pescoço do animal. Tecido conjuntivo em torno da veia é quebrada usando fórceps curvos e a veia é então elevado com uma barra de plástico estéril. Nós de sutura frouxas abertos são feitos em torno de cada extremidade do veio e o tubo do cateter é enfiado através do nó superior e enrolado sobre o fio de sutura para descansar desapertada sobre o ombro direito. Antes da inserção, molhada tanto a agulha de 20 gauge e a inserção da veia com solução salina estéril para reduzir a fricção. A agulha é conduzido paralelamente à veia, e inserido suavemente perto da parte inferior da veia elevado (Nota: aproximadamente 0,5 cm da ponta da agulha tem de entrar na veia). Usando fórceps, deslizar o tubo do cateter para baixo do eixo da agulha na veia. Resistência poderia indicar que o tubo is no interior do tecido conjuntivo, e não no interior da veia. Empurre 0,03 cc de soro na veia para ter certeza de que não há vazamentos. Vazamentos indicaria que a veia pode ser perfurado ou que a colocação de tubo do cateter precisa de ajuste. Nota: Para verificar se o tubo está dentro da veia, tentar tirar um pouco de sangue usando a seringa anexa salina. Se o sangue não pode ser imediatamente puxado para cima, a nervura ou parede do coração pode ser a oclusão da ponta do cateter, ou a veia não foi perfurada; ajustar o tubo e tentar de novo. Agulha reinserção pode ser necessária se o sangue ainda não pode ser elaborado. A fim de proteger o cateter no lugar, empurrar a lâmpada cateter para o ponto de inserção e remoção da agulha. Amarrar o nó inferior e puxe a descarga cateter contra o bar antes de amarrar o nó direito segundo acima do bulbo. Teste novamente para ver se o sangue pode ser elaborado e afrouxar os nós um pouco, se necessário. Dobrar o tubo do cateter sob a pele e suturaa incisão ventral em volta do pescoço do animal. Aplicar Polysporin Cura rápida usando um aplicador com ponta de algodão estéril, ou qualquer outra pomada de antibiótico, de preferência contendo um pouco de analgésico para a incisão fechada. Com o animal no seu abdómen, coloque a base do cateter sob a pele das costas dentro da incisão preparada. Certifique-se de que o tubo em excesso é minimamente em loop e bem escondida sob a base de cateter para minimizar as chances de o animal mastigar e perfurando-o. Sutura da incisão em ambos os lados da base do cateter, e aplicar rápida Cura Polysporin utilizando um aplicador de ponta de algodão esterilizado. Lave o cateter com 0,03 cc da solução de ticarcilina heparinizado utilizando a seringa com o tubo fixado na mesma (secção 3.2). Tapar a cânula com a tampa da cânula de plástico e parafuso da tampa cateter branco. Em alguns ratos que são frescos de uma cirurgia, o sangue pode sair do cateter antes da cânula é limitado. É importante voltar a lavar o animal e rapidly recoloque a tampa da cânula antes que o sangue tem a chance de fluir para fora. Os animais devem ser lavadas numa base diária para manter a desobstrução do cateter. Depois limpando a área de injecção entre os animais de volta pernas com etanol a 70%, por via subcutânea, injectar o cetoprofeno analgésico numa dose de 5 mg / kg de um lado, e a amikicin antibiótico numa dose de 10 mg / kg, do outro lado. Após a anestesia é interrompida, os animais são deixados recuperar em uma gaiola limpa com fácil acesso a comida e água durante 5 a 7 dias. Mice deve ser colocado num armário de aquecimento durante a noite para evitar a hipotermia pós-operatória. 5. Teste comportamental – intravenosa auto-administração Antes do teste comportamental cateteres são lavados com 0,9% de solução salina estéril. Os ratos são então colocard nas câmaras operantes e conectados às linhas de perfusão e de bombas de infusão. Pressiona a alavanca activas resultar em um 3,2 seg infusão da droga 18 ul juntamente com a iluminação de uma luz de estímulo. Cada pressão da alavanca é seguida por um período de tempo sec 8 período durante o qual a luz de estímulo permanece ligado. Após a sessão de operante, cateteres ratos são lavadas com a solução de ticarcilina heparinizado, antes de ser devolvido à sua gaiola de origem. Ratos são permitidos para auto-administrar durante 3 hr consecutivos 2-sessões em cada dose. As doses foram apresentados numa ordem aleatória para cada rato, tal como mostrado na secção que se segue. Permeabilidade do cateter é avaliada diariamente, assegurando que tanto a solução salina e antibióticos pode ser lavado por meio do cateter. Além disso, um teste de cetamina / midazolam pode ser conduzido tal como descrito na referência em anexo 5. Em resumo, os sinais de anestesia, tais como dentro de 5 segundos a imobilidade de uma infusão de 0,02-0,03 ml de cetamina (15 mg / ml),ou midazolam (0,75 mg / ml) midazolam é evidência de um cateter de patente 5.