Les méthodes de l'administration par voie intraveineuse auto dans un modèle de souris

1. Procédures de logement des animaux et d'acclimatation Mâles et femelles souris CD-1 sont logés de même sexe de la même portée, jusqu'à 5 animaux par cage, dans des cages en plastique contenant des standards literie puce bêta et plaquettes nestlet, avec des couvercles de treillis métallique pour accueillir des bouteilles d'eau et de nourriture. Norme de la souris chow et de l'eau sont disponibles ad libitum dans les cages à domicile toute l'expérience. Les souris sont maintenues sur un revers clair-obscur calendrier (lumières allumées 22h00-10h00). Les souris sont autorisés à s'acclimater aux salles de test IVSA pendant une semaine avant le début des procédures expérimentales. 2. Formation opérant Toutes les procédures de comportement, y compris la formation du lait sucré et de drogues intraveineuses d'auto-administration sessions sont réalisées en utilisant des chambres de mesure opérant 15,9 x 14 x 12,7 cm, équipé de 2 leviers de souris ultra-sensibles, balanciers tasses, lampes de relance et de pompes à seringue microlitre (Med Assoates Inc, St. Albans, VT, USA). Chambres sont reliés à un ordinateur à l'aide Associés Med intelligente CR interface et Med-PC pour programmer l'horaire de renforcement et de collecter des données. Souris naïves sont habitués aux chambres opérantes et formés pour appuyer sur le levier à l'aide d'une récompense lait sucré (0,1 ml) a présenté dans une tasse de bras. La formation du lait opérant est effectuée en 1-hr sessions pendant 5-7 jours. Achèvement d'un rapport (FR) horaire fixe sur le levier actif abouti à la présentation de la coupe bras et de l'éclairage d'une lumière de relance. La solution consistait lait sucré du saccharose (10 mg / ml, réactif ACS, Sigma-Aldrich Inc St-Louis MO, USA) ajouté au lait entier (3,25% de matière grasse). Formation opérant avec une solution de lait sucré ou un renforçateur alimentaire liquide est une technique couramment utilisée pour faciliter opérant répondre à 1,2 chez la souris. 3. Préparation de l'équipement doit être utilisé pendant la chirurgie Requéquipements ired – 20, 23 et 26 aiguilles de calibre, broyeur, seringues de 1 cc, tubes Tygon, fer à souder, l'héparine, les antibiotiques et analgésiques. Préparer une aiguille pour guider l'insertion du cathéter dans la veine jugulaire par rasage vers le bas d'une aiguille de calibre 20. Le corps de l'aiguille est rasée bas à l'aide d'un broyeur pour former un canal à l'intérieur de l'aiguille afin de guider le tube de cathéter dans la veine. Le canal de l'aiguille doit être soigneusement vérifiée pour tout débris métalliques qui peuvent avoir été déposés. Tout obstacle à la chaîne devrait être gratté à l'aide de fines pinces à pointe. Adapter deux seringues 1-cc pour être utilisés pour le rinçage et le contrôle du cathéter. Préparer deux seringues en prenant 12 cm morceaux de tube Tygon et les fixer à une extrémité d'aiguille de calibre 26 fixées sur des seringues de 1 cc, et en étirant les extrémités de la tubulure d'autres sur des aiguilles de calibre 23. Une seringue doit être rempli avec une solution saline stérile à 0,9% et l'autre avec une solution héparinée ticarcilline (33 mg de ticarcillineet 0,3 mg d'héparine pour 10 ml de solution saline stérile). Préparer cathéter bouchons canule. Tuyau Tygon est tendue sur une aiguille de calibre 23, et coupez 1 cm du biseau. Fondre l'extrémité ouverte du tube pour créer un joint épais. Le tube doit être fondu de sorte que le capuchon de canule ensemble est suffisamment long pour s'adapter au-dessus de la canule de cathéter, avec le raccord d'extrémité étanche serré sur l'extrémité de la canule. Notez que si le bouchon est trop long, il ya un risque que cela sera plié et ensuite percé au cours du processus de fixation de la vis sur le cathéter couvre. Ainsi, une préparation minutieuse des bouchons cathéter est recommandé, afin d'assurer un bon ajustement à la canule. Préparer les solutions nécessaires. Tous les réactifs ont été achetés chez Sigma-Aldrich Inc (St-Louis MO, USA). Hépariné solution Ticarcilline pour le rinçage du cathéter – Dissoudre 0,33 g ticarcilline (sel disodique) et 0,003 g d'héparine dans 10 ml de solution saline stérile. 0,03 ml de la solution est rincée through le cathéter par jour. La solution antibiotique est administré pour prévenir les caillots sanguins et des infections de se développer. Amikicin (antibiotique) pour injection sous-cutanée – Une seule injection sous-cutanée est donnée après une intervention chirurgicale à la dose de 10 mg / kg pour empêcher infections post-opératoires. Le kétoprofène (analgésique) pour injection sous-cutanée – Une seule injection sous-cutanée est donné suite à une chirurgie, à une dose de 5 mg / kg de gérer toute la douleur post-opératoire. 4. Chirurgie implantation par cathéter L'équipement et les réactifs: L'isoflurane, une solution saline stérile, de l'alcool (70%), 1 et 3 seringues cc remplie de sérum physiologique stérile, 1-cc seringues adaptées, solutions antibiotiques et analgésiques préparés à la section 3 ci-dessus, les cathéters de souris (CamCaths, Cambridgeshire, Royaume-Uni ), couvertures de cathéter (bouchons en cristal de HRS scientifiques, Montréal, Québec), le lubrifiant oculaire, 4 cm à barres en plastique pour élever veine (cepeuvent être construits à partir d'un plastique Q-tip), Polysporin, compresses stériles et de la gaze, des pinces courbes et droites, pinces artérielles, ciseaux fins. En utilisant des techniques aseptiques le banc chirurgicale, les instruments chirurgicaux et les cathéters sont stérilisés avant leur chirurgie. Techniques de stérilisation appropriées comprennent vapeur autoclave pour les instruments chirurgicaux et des cathéters achetés auprès CamCaths. Perle en verre de stérilisation peut aussi être utilisé sur les pointes des instruments chirurgicaux. Stérilisation à l'oxyde d'éthylène peut être employé sur des cathéters ou des matériaux plus délicats que les risques fusion. Une description plus détaillée des rongeurs techniques chirurgicales aseptiques peuvent être trouvées dans le 1,2-joint références. Mise en place de la banquette, les instruments et le cône de nez pour entretien de l'anesthésie est illustré sur la photo. Les souris sont anesthésiées avec du gaz isoflurane, et maintenu sous anesthésie à l'aide d'un tube de respiration dans un système de balayage. Lubrifiant oculaire (Tears Naturale PM) est appliquée aux deux yeux pour les empêcher de sécher pendant la procédure. Une marge appropriée chirurgical est rasé sur le dos de l'animal et autour du cou. Avant toute incisions sont faites, les champs opératoires sont restreintes à l'aide des champs stériles. En vue de préparer le cathéter pour l'insertion dans l'oreillette droite du coeur, le tube de cathéter en excès est coupé 1,2 cm à partir de l'ampoule du cathéter. Il s'agit de la longueur optimale établie pour adultes souris CD-1, environ 8 semaines d'âge, 20-25 grammes de poids corporel. La longueur du tube du cathéter peut être nécessaire d'ajuster légèrement (par essais et erreurs), basé sur la souche, la taille et l'âge des souris. Avant l'insertion, la seringue contenant une solution saline stérile (section 3,2) est fixée à la canule de cathéter, et le cathéter est rincé et contrôler l'étanchéité. Gardercette seringue fixée au cathéter à travers l'intervention chirurgicale. Il sera utilisé pour rincer le cathéter, et reculer le sang à l'étape 4.7. Après une stérilisation avec de l'alcool 70%, une longue incision 2 cm midscapular est faite à partir mi-chemin sur le dos et se terminant juste au-dessous du cou, afin de s'adapter à la base du cathéter. Tissu conjonctif doit être écartées avec des pinces pour faire place à l'embase du cathéter sous la peau. Placer l'animal sur son dos, un peu profonde seconde de 1 à 2 cm de diagonale incision est faite à partir de la clavicule droite en allant vers le haut à la mâchoire animaux, après que la zone a été nettoyée à l'alcool à 70%. La veine jugulaire se trouvent superficiellement sous la peau du cou. En vue de l'insertion du cathéter, un tube à partir de la base du cathéter est tiré à travers l'incision dans le dos et amenée à proximité de la veine jugulaire par le passage du tube sous la peau juste au-dessus de l'épaule droite. L'extrémité du tube de cathéter estensuite fixé à une pince artérielle et placé à côté de l'animal pour le maintenir en place. La veine jugulaire droite est situé en s'éloignant doucement conjonctif et le tissu adipeux superficiel de l'incision autour du cou de l'animal. Tissu conjonctif autour de la veine est décomposée en utilisant une pince courbe et la veine est ensuite élevé en utilisant une barre de plastique stérile. Lâches noeuds de suture sont réalisés ouverts autour de chaque extrémité de la veine et le tube de cathéter est enfilé à travers le noeud haut et enroulée sur le fil de suture au repos desserrée sur l'épaule droite. Avant l'insertion, par voie humide à la fois l'aiguille d'insertion de jauge 20 et la veine avec une solution saline stérile pour réduire la friction. L'aiguille est maintenue parallèle à la veine, et inséré doucement dans la partie inférieure de la veine élevée (Remarque: environ 0,5 cm de la pointe de l'aiguille doit pénétrer dans la veine). En utilisant des pinces, faites glisser le tube du cathéter dans le puits de l'aiguille dans la veine. Résistance indiquerait que le tube is dans le tissu conjonctif et non dans la veine. Poussez 0,03 cc de sérum physiologique dans la veine de s'assurer qu'il n'ya pas de fuites. Fuites indiquerait que la veine peut être percé ou que le placement tube du cathéter doit être réglé. Remarque: Pour vérifier si le tube est dans la même veine, essayer de dresser un peu de sang à l'aide de la seringue ci-joint une solution saline. Si le sang ne peut être immédiatement établi, la veine ou paroi cardiaque peut être occlusion de l'extrémité du cathéter, ou la veine n'a pas été percé, régler le tube et essayez à nouveau. Aiguille réinsertion peut être nécessaire si le sang ne peut toujours pas être établie. Afin de fixer le cathéter en place, poussez l'ampoule cathéter pour le point d'insertion et retirer l'aiguille. Attacher le noeud en bas, puis tirez la chasse d'eau cathéter contre la barre avant d'attacher le droit second nœud au-dessus de l'ampoule. Testez à nouveau pour voir si le sang peut être établi et desserrer les nœuds légèrement si nécessaire. Rentrer le tube de cathéter sous la peau et suturel'incision ventrale autour du cou de l'animal. Appliquer Polysporin guérir rapidement à l'aide d'un applicateur de coton stérile pointe, ou de toute autre pommade antibiotique contenant de préférence une certaine analgésique de l'incision fermé. Avec l'animal sur son abdomen, placer l'embase du cathéter sous la peau de l'arrière à l'intérieur de l'incision préparée. Assurez-vous que le tube supérieur est très peu bouclés et bien cachée sous l'embase du cathéter afin de minimiser les chances de l'animal à mâcher et le percer. Suturer l'incision des deux côtés de l'embase du cathéter, et appliquer de production rapide Guérison Polysporin l'aide d'un applicateur de coton stérile extrémité. Rincer le cathéter avec 0,03 cc de la solution héparinée ticarcilline aide de la seringue avec le tube fixé sur celui-ci (section 3.2). Cap de la canule avec le capuchon en plastique canule et visser le couvercle cathéter blanc. Chez certaines souris qui sont frais de la chirurgie, le sang peut s'écouler du cathéter avant que la canule est plafonné. Il est important de re-rincer l'animal et rapidly remplacer le capuchon de canule avant que le sang a la chance de s'échapper. Les animaux doivent être rincés quotidiennement pour maintenir la perméabilité du cathéter. Après avoir essuyer la zone d'injection entre les animaux dos les jambes avec de l'éthanol à 70%, sous-cutanée injecter le kétoprofène analgésique à la dose de 5 mg / kg d'un côté, et le amikicin antibiotique à la dose de 10 mg / kg de l'autre côté. Après anesthésie est interrompue, les animaux sont autorisés à récupérer dans une cage propre avec un accès facile à la nourriture et à l'eau pendant 5 à 7 jours. Les souris doivent être placés dans une enceinte chauffée pendant la nuit pour éviter l'hypothermie post-opératoire. 5. Test comportemental – auto-administration intraveineuse Avant de cathéters d'essais comportementaux sont rincées avec une solution saline stérile à 0,9%. Les souris sont ensuite placerd opérant dans les chambres et relié à des lignes de perfusion et les pompes de perfusion. Presses levier actif entraîner un 3,2 sec 18 ul d'injection de médicament associé à l'éclairement d'une lumière de stimulation. Chaque levier de pression est suivie d'un temps de 8 s sur la période au cours de laquelle la lumière de stimulation reste allumé. Après la séance opérant, cathéters souris sont rincés avec la solution héparinée ticarcilline avant d'être remis dans leur cage. Les souris sont autorisés à s'auto-administrer pendant 3 h consécutives 2-sessions à chaque dose. Les doses ont été présentés dans un ordre aléatoire pour chaque souris, comme indiqué dans la section suivante. La perméabilité du cathéter est évalué quotidiennement en veillant à ce que tant la solution saline et antibiotique peut être rincé par le cathéter. En outre, un test de kétamine / midazolam peut être réalisée comme décrit dans la référence ci-joint 5. En bref, les signes de l'anesthésie comme l'immobilité dans les 5 secondes d'une infusion de de 0.02 à 0.03 ml de kétamine (15 mg / ml),ou le midazolam (0,75 mg / ml) midazolam est la preuve d'un cathéter 5 brevets.