Quantificazione di colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine Uso Bioassays Kernel
Summary
La devastazione delle colture di cereali da semi-infezione funghi ha spinto numerosi sforzi di ricerca per comprendere meglio le interazioni pianta-patogeno. Per studiare le interazioni semi-fungine in un ambiente di laboratorio, abbiamo sviluppato un metodo affidabile per la quantificazione della riproduzione fungina, la biomassa, e la contaminazione da micotossine mediante biotest del kernel.
Abstract
La putrefazione di cereali da seme-infettanti funghi rappresenta una delle più grandi sfide economiche a livello mondiale di produzione di cereali, per non parlare di gravi rischi per la salute umana e animale. Tra la produzione di cereali, il mais è probabilmente la coltura più colpita, a causa di agenti patogeni indotte perdite di integrità del grano e di semi di contaminazione da micotossine. I due micotossine più diffuse e problematiche per i coltivatori di mais e degli alimenti e dei mangimi sono processori aflatossina e fumonisina, prodotta da Aspergillus flavus e Fusarium verticillioides, rispettivamente.
Recenti studi molecolari delle interazioni pianta-patogeno hanno dimostrato promessa la comprensione dei meccanismi specifici associati con le risposte delle piante alle infezioni fungine e contaminazione da micotossine 1,2,3,4,5,6. Poiché molti laboratori utilizzando saggi kernel per studiare le interazioni pianta-patogeno, vi è la necessità di un metodo standard per quantificare diversi parametri biologici, cosìrisultati dei diversi laboratori possono essere cross-interpretato. Per un mezzo robusto e riproducibili per le analisi quantitative sui semi, abbiamo sviluppato in laboratorio e metodi di test del kernel successivi per quantificare la crescita di funghi, biomasse e contaminazione da micotossine. Quattro chicchi di mais sterilizzati vengono inoculati in fiale di vetro con una sospensione fungina (10 6) e incubati per un periodo predeterminato. Vial vengono scelti per il conteggio di conidi mediante analisi biomassa emocitometro, ergosterolo basato mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), quantificazione aflatossine utilizzando un metodo AflaTest fluorometro, e quantificazione fumonisina mediante HPLC.
Protocol
Discussion
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Brandon Hassett e Carlos Ortiz per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal contributi NSF IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS-0925561 e al Dr. Michael Kolomiets, e dalla USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), la selezione vegetale AFRI e borsa di studio # 2010-85117 -20.539 a Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit e Kolomiets Michael.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog # |
| Potato Dextrose Agar | Fisher Scientifc | S71659A |
| Tween-20 | Fisher Scientifc | BP337-100 |
| Plastic incubation container | Sterilite | 1713LAB06 |
| Blender | Vicam | 20200 |
| 24 cm Fluted Filter Papers | Vicam | 31240 |
| 1.5 μm glass microfibre | Vicam | 31955 |
| Afla Test column | Vicam | G1024 |
| Afrla Test Developer | Vicam | 32010 |
| Methanol | Vicam | 35016 |
| Acetonitrile | Fisher Scientifc | AC14952-0025 |
| Ethanol | Fisher Scientifc | AC39769-0025 |
| C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) | Fisher Scientifc | 60108-304 |
| O-phthalaldehyde (OPA) | Sigma Chemical Co | 79760-5g |
| Boric acid | Fisher Scientifc | BP168-500 |
| Sodium borate | Fisher Scientifc | RDCS0330500 |
| Mercaptoethanol | Fisher Scientifc | 45-000-231 |
| Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | LC-20AT |
| Zorbax ODS column (4.6x150mm) | Agilent Technologies | 443905-902 |
| Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | RF-10AXL |
| Sodium phosphate | Fisher Scientifc | AC38987-0010 |
| FB1 standards | Sigma Chemical Co. | F1147-1mg |
| Chloroform | VWR | MK444410 |
| 13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) | Pall Life Science | 4426 |
| Ergosterol | Sigma-Aldrich | 45480-50G-F |
| Scintillation vials | VWR | 66021-602 |
| Sodium Chloride | Vicam | G1124 |
References
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