Imaging intravitale del Nodo poplitea Lymph mouse

1. Mouse Holder Assembly Sovrapporre il coperchio di 100-mm piatto di vetro Petri su una 100-mm coperchio di plastica capsula Petri rivolto verso il basso. Il vetro deve essere appena tocca il punto centrale del piatto di plastica. Utilizzando il vetro come stencil, tracciare un segno sul piatto di plastica. Utilizzare un trapano a mano (cioè Dremel) per rimuovere una porzione di un coperchio 100-mm piatto di plastica per creare una forma di mezzaluna piattaforma. Questa forma di mezzaluna coperchio di plastica servirà come supporto per il torso superiore del topo (Figura 1a). Praticare due fori sul coperchio a forma di mezzaluna per fissare la maschera antigas con una fascetta di metallo torsione. Fissare il coperchio di plastica al bordo del piatto di vetro Petri con super colla o un adesivo equivalente forte (Figura 1b). Colla i coperchi di due cupola-PCR tappo provette (tagliati a cerniera) 1 cm di distanza dal centro del piatto inferiore allo scopo di ancoraggio lembi cutanei poplitei. 2. Preparazione del mouse <strong> Nota: Con la pratica sufficiente, si dovrebbe essere in grado di eseguire la preparazione del mouse e fasi chirurgiche in 20-30 minuti. Anestetizzare il mouse con isoflurano (2 al 2,5% per l'induzione, 1,5 al 2% per l'intervento / imaging) miscelati in 1:01 O 2: miscela aria ad una velocità di flusso di 1L/min utilizzando un IACUC approvato procedura. Una volta che il mouse è anestetizzato, fissare una maschera antigas sul naso con nastro adesivo. Determinare se il mouse è completamente anestetizzato dalla mancanza di risposta ai piedi e / o pizzichi coda. Il livello di isoflurano può essere regolata di conseguenza per assicurare l'animale è completamente sedato, con una costante, non lavorò frequenza respiratoria tra 60-80 respiri al minuto. Utilizzare un trimmer elettrico per eliminare i peli sulla zampa posteriore destra e la zona inguinale del mouse. Spazzolare via i capelli sciolti e delicatamente applicare una mano modesta di lozione Nair sulla zona rasata con un batuffolo di cotone. Dopo un minuto di applicazione iniziale, togliere la Nair e pulire la pelle esposta con un panno umidotovagliolo di carta. Assicurarsi che il mouse sia pulita e asciutta prima di procedere. Fai una piccola incisione 2-3 mm con le forbici al ginocchio destro per esporre il tendine estensore. Applicare Vetbond lungo il centro del supporto topo dove il corpo e la gamba del mouse viene posizionato. Fissare con cura il mouse sul supporto, con il ginocchio destro verso il basso, per esporre la fossa poplitea destra. Fissare il tendine ginocchio destro con Vetbond tra i titolari della pelle 2 ribalte per contribuire a stabilizzare il settore imaging. Stretch nastro e le braccia e la gamba sinistra alla piattaforma superiore del supporto. Utilizzare una fascetta torsione per fissare la maschera antigas al suo posto. Collocare il supporto sotto il microscopio di dissezione. Il LN deve rimanere immobile, indipendente dal movimento del mouse respirazione. Pertanto, devono essere prese precauzioni durante operazioni chirurgiche per ottimizzare la stabilità della gamba. Determinare la posizione della coda (tipicamente sopra la testa) che contribuiranno alla massimastabilità alla gamba destra e il nastro la coda verso il basso. 3. Chirurgia Mentre nel campo di applicazione dissezione, mantenere la temperatura corporea del mouse utilizzando una stufetta o una piastra elettrica. Per immagine positiva del LN poplitea, è fondamentale per sostenere la corretta temperatura del corpo durante la chirurgia così come per preservare l'umidità del tessuto costantemente applicando caldo PBS al tessuto esposta. Sterilizzare la pelle con Betadine. Utilizzando forbici sterili, praticare un'incisione mediana attraverso la pelle a destra a metà polpaccio, e continuare a tagliare verticalmente fino alla parte superiore della coscia destra. Fare due incisioni cutanee orizzontali nella parte superiore della linea di incisione verticale per creare lembi cutanei su entrambi i lati. Ritrarre e colla premuti entrambi i lembi cutanei con Vetbond. Tirando la pelle tesa prima di applicare Vetbond permetterà di promuovere ulteriormente la stabilità della gamba, tuttavia, accertarsi che la tensione della pelle non occlude il flusso sanguigno (ossia a cambiamenti nella vessel colore o diametro). Continuare ad incollaggio altre aree della pelle per assicurare la stabilità della gamba prima di esporre la LN. La dimensione del mouse determinare la quantità di pelle è richiesta per incollaggio. In genere, i topi più grandi richiederà più la pelle da incollare al titolare. La LN devono ricadere all'interno della fossa poplitea sia a destra oa sinistra della vena poplitea, a seconda della posizione del mouse sul supporto. Separare con attenzione il LN dai tessuti adiposi e muscoli circostanti che utilizzano micro-dissezione pinzette e pinze. Per ridurre al minimo il sanguinamento e trauma, utilizzare le tecniche dispiegamento con micro-dissezione pinzette ai tessuti separati. Con attenzione esporre la LN poplitea senza compromettere l'integrità dei vasi sanguigni afferenti ed efferenti e dei vasi linfatici afferenti. Per la stabilità del tessuto aggiunto, un vetro di copertura quadrato può essere posizionato sopra la LN umida, appena toccando il LN evitando l'occlusione del vaso. Il vetro di copertura può essere SECURed modellare con argilla su entrambi i lati del mouse. Coloranti fluorescenti vaso di varie dimensioni (ad esempio TRITC-destrano, minimo di 70kDa) possono essere introdotti per via endovenosa a questo punto per aiutare evidenziare il rapporto strutturale e l'integrità del LN durante l'imaging. 4. 2-Photon Imaging Acquisition ** Una volta che la LN sia adeguatamente esposta e la stabilità viene raggiunta, a trasferire rapidamente l'intero gruppo porta mouse sul microscopio scena munito di un pad programmabile retroazione riscaldamento a temperatura controllata in una camera ambientale microscopio mantenuta a 37 ° C. Aggiungi abbastanza sterile calda (37 ° C) o PBS HBSS far immergere la LN. Il volume cambia a seconda della dimensione e la posizione del mouse. In alternativa, calda o PBS HBSS può essere applicato direttamente al LN sezionato attraverso una pipetta di vetro fine montata una pompa peristaltica e registrato alla colonna della lente obiettivo ad immersione. Il flusso del liquido deve essere tale dacolonna d'acqua può essere mantenuta stabile tra la lente e il tessuto. Mantenere la temperatura HBSS o PBS a 37 ° C usando un tampone di riscaldamento con una sonda di retroazione. Una sonda di temperatura separata deve essere inserito nel supporto mouse per confermare la temperatura del PBS nell'intervallo di 36,5-37,5 ° C. Una sonda rettale può anche essere usato per monitorare la temperatura corporea del mouse sperimentale per tutta la sessione di imaging. Utilizzare un epi-lampada fluorescente per aiutare il posizionamento LN guida sotto l'obiettivo. Acquisire serie di immagini fluorescenti che utilizzano intervalli di tempo che sono appropriate per l'interazione cellulare desiderata (in genere da 10 secondi a 1 minuto tra ogni serie di immagini xyz). Monitorare lo stato dell'animale nella camera microscopio frequentemente mediante ispezione visiva o utilizzando un sistema di monitoraggio animale. Determinare se il mouse è completamente anestetizzato dalla mancanza di risposta ai piedi e / o pizzichi di chiodi, e una costante, non lavorò frequenza respiratoria tra i 60-80 breaths / min. Il livello di isoflurano può essere regolato di conseguenza per assicurare che l'animale è completamente sedato. Con un adeguato monitoraggio e l'idratazione, gli animali possono essere esposte per 4-6 ore, o forse più. Dopo l'esperimento di imaging, l'eutanasia l'animale in una camera di CO 2 con IACUC approvato protocollo di eutanasia. L'animale non dovrebbe essere permesso di uscire da anestesia prima all'eutanasia. ** Questa procedura chirurgica può essere utile anche per altre forme di imaging intravitale diverso da 2P-LSM. 5. Risultati rappresentativi Diverse le cellule immunitarie circolanti vengono reclutati alla LN a ritmi diversi a seguito di trasferimento adottivo. Per CD4 + e CD8 + linfociti, queste cellule cominciano ad arrivare nel LN attraverso le venule endoteliali alte (HEV) minuti dopo il trasferimento iv con i numeri consistenti che arrivano nella LN popliteo dopo 2 a 4 ore 6,17-18. Per B cells, un numero considerevole si accumulano dopo 8 a 24 ore 19. Dendritiche attivate dovrebbe iniziare ad apparire nei drenanti poplitea LN 8 a 16 ore dopo l'iniezione footpad 3,11,16-17. La figura 2a mostra che anche senza altri punti di riferimento, strutture come follicoli di cellule B possono essere individuate facilmente l'accumulo rotonda cella sferica visibile sotto 2P-LSM 19. L'utilizzo di un giornalista endogena fluorescente come i ubiquitina-GFP splenociti (Figura 2, video supplementari 1 e 2), si può tenere traccia di queste migrazioni di linfociti e comportamenti per giorni fino a una settimana in condizioni non-stimolatori condizioni fisiologiche. Con il multi-canale rivelatori ad alta sensibilità, è possibile acquisire un set di dati di imaging multiplex che comprende informazioni sulla struttura e le dinamiche di interazione tra più partner cellulari 17,19. Quando le tecniche chirurgiche siano eseguiti correttamente e le condizioni ambientali attentamente monitorato, lymphocytes deve presentare caratteristiche di velocità di migrazione, come mostrato nella Figura 2c, 2d e altrove 13-14,16. I linfociti si possono presentare anche differenze nella velocità di migrazione a seconda delle sub-regioni della LN in fase di imaging, così ulteriori punti di riferimento come i vasi sanguigni (come evidenziato dalla introduzione di coloranti nave) contribuirà a determinare la qualità complessiva imaging (ad esempio il controllo della temperatura corretta , minimo trauma alla LN, ecc) 3,6,20. Figura 1. Costruzione di un supporto per mouse per il mouse popliteo LN Imaging a) Schema di montaggio del mouse titolare;. B) preparazione del mouse Rappresentante intravitale; c) Completato il montaggio supporto per mouse; d) Close-up vista della LN popliteo dopo l'esposizione chirurgica. Figura 2. Analisi migrazione di GFP + linfocitinel LN poplitea. (a) istantanea 3D presa da 2P-LSM sequenza di immagini del LN poplitea in C57BL / 6 topo ricevente adoptively trasferito con 1×10 7 GFP + linfociti 1 giorno prima di imaging. Linea tratteggiata indica il confine di follicoli di cellule B, (b) tracce di migrazione dei linfociti durante 1 ora di continuo immagini; c) la distribuzione complessiva di velocità di migrazione dei linfociti. Velocità media = 10,04 ± 4,26 micron al minuto (per un totale di 15.125 brani analizzati), d), differenziale cellulare distribuzione velocità di migrazione delle cellule presenti nel follicolo delle cellule B (bar aperto; velocità media = 8.79 ± 3.90 micron / min; totale 1.525 brani analizzati ) e delle cellule T della zona (bar chiusi, velocità media = 13,77 ± 5.93 micron / min; di un totale di 1.250 brani analizzati). Scala bar = 50 micron. Supplemental Video 1. Time-lapse intravitale 2P-LSM immagini di un topo LN popliteo come descritto nella Figura 2. Un totale di 1×10 7 linfociti sono stati isolati from uno ubiquitina-GFP + topo donatore e adoptively trasferito per via endovenosa in un topo ricevente C57BL / 6 24 ore prima di imaging. Una serie di xy (750 um x 750 um) immagini di fluorescenza sono state prese attraverso fisso z pile (5 passi micron, 13 passi) per generare un pila xyz immagini (750 um x 750 um x 65 um), che è stata ripetuta ogni 20 secondi per un totale di 60 minuti, risultando in una sequenza di imaging xyzt per l'analisi della velocità (figure 2c, 2d). La velocità di riproduzione = 450X. Scala bar = 50 micron. Time stamp = min: sec. Clicca qui per guardare il video supplementare . Supplementare Video 2 vista ingrandita della sequenza di imaging in Video supplementare 1 al follicolo cellula B -. Cellule T confine di zona. La velocità di riproduzione = 450X. Scala bar = 25 micron. Data e ora = min: sec. Cleccare qui per guardare il video supplementare.