Imagerie intravitale du ganglion lymphatique poplité souris

1. Assemblée porte-souris Superposez le couvercle d'un plat en verre de 100 mm sur le dessus de Petri de 100 mm couvercle de boîte de Petri en plastique vers le bas. Le verre doit être touchant à peine le point de centre de l'assiette en plastique. Utilisation de la vitre comme un pochoir, tracer une marque sur le plat en plastique. Utilisation d'une perceuse à main (c.-à-dermiques) pour enlever une partie d'un couvercle plat de 100 mm plastique pour créer une plate-forme en forme de croissant. Ce couvercle en plastique en forme de croissant se servir de support pour la partie supérieure du torse de la souris (figure 1a). Percez deux trous sur le couvercle en forme de croissant pour assurer le masque à gaz avec une attache en métal. Fixez le couvercle en plastique sur le bord du plat en verre de Petri en utilisant la super glue ou un adhésif de manière équivalente forte (figure 1b). Coller les couvercles en forme de dôme de deux tubes PCR bouchon (coupés à la charnière) 1 cm de distance au centre de la cuvette inférieure dans le but de rabats d'ancrage de la peau poplités. 2. Préparation de la souris <strong> Remarque: Avec une expérience pratique suffisante, il faut être en mesure d'effectuer la préparation de la souris et les étapes chirurgicales en 20-30 minutes. Anesthésier la souris avec l'isoflurane (2 à 2,5% pour l'induction, de 1,5 à 2% pour la chirurgie / imagerie) mélangé à l'échelle 1:1 O 2: mélange l'air à un débit de 1l/min en utilisant une procédure IACUC approuvé. Une fois que la souris est anesthésiée, sécuriser un masque à gaz sur le nez avec du ruban adhésif. Déterminer si la souris est entièrement anesthésié par l'absence de réponse aux pieds et / ou pincées queue. Le niveau de l'isoflurane peut être ajustée en conséquence pour s'assurer que l'animal est complètement sous sédation, avec une constante, non-travaillé fréquence respiratoire entre 60-80 respirations par minute. Utilisez une tondeuse électrique pour enlever les poils sur la patte arrière droite et la région inguinale de la souris. Toute trace de cheveux dénoués et en douceur, appliquer une couche modeste de la lotion sur la zone Nair rasée avec un coton-tige. Après une minute de la demande initiale, retirez le Nair et nettoyer la peau exposée avec un chiffon humideserviette en papier. Assurez-vous que la souris est propre et sèche avant de continuer. Faire une petite incision de 2 à 3 mm avec des ciseaux au niveau du genou droit d'exposer le tendon extenseur. Appliquer Vetbond le long du centre du support de souris, où le corps de la souris et la jambe sera positionné. Fixez soigneusement la souris sur le support, avec le genou droit vers le bas, afin d'exposer la fosse poplitée droite. Fixez le tendon du genou droit avec Vetbond entre les 2 supports lambeau de peau pour aider à stabiliser le champ d'imagerie. Stretch et ruban adhésif sur les bras et la jambe gauche à la plate-forme supérieure de la porte. Utilisez une attache pour fixer le masque à gaz en place. Placez le support sous le microscope à dissection. La LN doit rester absolument immobile, indépendante du mouvement respiratoire de la souris. Par conséquent, des précautions doivent être prises pendant la chirurgie afin d'optimiser la stabilité de la jambe. Déterminer la position de la queue (typiquement au-dessus de la tête) qui contribuera à la plus grandela stabilité à la jambe droite et la bande de la queue vers le bas. 3. Chirurgie Alors que dans le cadre du champ d'application de dissection, de maintenir la température du corps de la souris en utilisant un appareil de chauffage ou un coussin chauffant. Pour l'imagerie réussie de la LN poplitée, il est essentiel de maintenir la température du corps adéquate tout au long de la chirurgie ainsi que pour préserver l'humidité du tissu par l'application constante chaude PBS pour les tissus exposés. Stériliser la peau avec de la Bétadine. L'aide de ciseaux stériles, faire une incision médiane à travers la peau à droite à mi-mollet, et continuez à couper verticalement vers le haut à la partie supérieure de la cuisse droite. Faire deux incisions cutanées horizontales en haut de la ligne d'incision verticale pour créer lambeaux cutanés de chaque côté. Rentrer et collez-le deux lambeaux cutanés avec Vetbond. Tirer la peau tendue avant d'appliquer Vetbond permettra de promouvoir davantage la stabilité jambe, mais assurez-vous que la tension de la peau n'a pas obstruer la circulation sanguine (à savoir les changements de la vesseL Couleur ou diamètre). Continuer à coller par d'autres secteurs de la peau pour assurer la stabilité de la jambe avant d'exposer la LN. La taille de la souris permettra de déterminer combien la peau supplémentaire est nécessaire pour la colle vers le bas. En règle générale, les grandes souris, il faudra plus de peau à être collé à la porte. La LN doit se situer dans la fosse poplitée, soit à droite ou à gauche de la veine poplitée, en fonction de la mise en place de la souris sur le support. Soigneusement séparer la LN à partir de tissus adipeux et les muscles qui entourent l'aide de micro-dissection des pincettes et des pinces. Afin de minimiser les saignements et les traumatismes, utiliser les techniques écarteurs avec des micro-dissection pince à épiler pour les tissus distincts. Dégager prudemment la LN poplitée sans compromettre l'intégrité des vaisseaux sanguins afférents et efférents et les vaisseaux lymphatiques afférents. Pour la stabilité des tissus ajouté, un couvercle en verre carré peut être positionné au-dessus de la LN humide, à peine de toucher la LN, tout en évitant occlusion du vaisseau. Le couvercle en verre peut être sécured avec la pâte à modeler de chaque côté de la souris. Colorants fluorescents de navires de différentes tailles (par exemple TRITC-dextran, minimum de 70 kDa) peuvent être introduits par voie intraveineuse à ce point pour aider à mettre en évidence la relation structurelle et l'intégrité du LN lors de l'imagerie. 4. 2-Photon Imaging Acquisition ** Une fois que la LN est suffisamment exposée et la stabilité est obtenue, transférer rapidement l'ensemble de la souris tout support sur la platine du microscope muni d'un tampon de température retour chauffage programmable contrôlé dans une chambre de l'environnement microscope maintenue à 37 ° C. Ajouter assez stérile chaude (37 ° C) ou PBS HBSS à submerger la LN. Le volume change en fonction de la taille et l'emplacement de la souris. Alternativement, chaleureux PBS ou HBSS peut être appliqué directement sur la LN disséquée à travers une pipette en verre bien adapté à une pompe péristaltique et scotchée à la colonne de l'objectif objectif à immersion. Le débit du liquide doit être telle que lecolonne d'eau stable peut être maintenu entre la lentille et le tissu. Maintenir la température de PBS ou HBSS à 37 ° C à l'aide d'un coussin chauffant avec une sonde de rétroaction. Une sonde de température distincte doit être placé dans le support de la souris pour confirmer la température de la PBS dans la plage de 36,5 à 37,5 ° C Une sonde rectale peut également être utilisé pour surveiller la température centrale du corps de la souris expérimentale long de la session d'imagerie. Utilisez une lampe fluorescente epi-pour aider le placement LN guide sous l'objectif. Acquérir piles d'images fluorescentes à l'aide des intervalles de temps qui sont appropriés pour l'interaction cellulaire désiré (généralement de 10 secondes à 1 minute entre chaque pile d'images xyz). Surveiller l'état de l'animal dans la chambre du microscope souvent par inspection visuelle ou en utilisant un système de surveillance des animaux. Déterminer si la souris est entièrement anesthésié par l'absence de réponse aux pieds et / ou pincées ongles, et une constante, non-travaillé le rythme respiratoire de 60-80 breaths par minute. Le niveau de l'isoflurane peut être ajustée en conséquence pour s'assurer que l'animal est complètement sous sédation. Avec un suivi adéquat et une hydratation, les animaux peuvent être visualisés pendant 4-6 heures, ou peut-être plus. Après l'expérience d'imagerie, euthanasier l'animal dans un chambre de CO 2 en utilisant le protocole approuvé par l'euthanasie IACUC. L'animal ne doit pas être autorisé à sortir de l'anesthésie avant l'euthanasie. ** Cette procédure chirurgicale peut aussi être utile pour d'autres formes d'imagerie intravitale autre que 2P-LSM. 5. Les résultats représentatifs Diverses cellules immunitaires circulantes sont recrutés à la LN à des taux différents suivant le transfert adoptif. Pour CD4 + et CD8 + lymphocytes, ces cellules commencent à arriver dans la LN dans les hautes endothéliales veinules (HEV) minutes après le transfert iv avec un nombre substantiel qui arrivent dans la LN poplitée après 2 à 4 heures 6,17-18. Pour cel Bls, un nombre important s'accumulent au bout de 8 à 24 heures 19. PED activés devraient commencer à apparaître dans les drainant poplités LN 8 à 16 heures après l'injection du coussinet plantaire 3,11,16-17. La figure 2a montre que, même sans autres repères, des structures telles que les follicules de cellules B peuvent être discernées facilement par l'accumulation de cellules sphériques ronde visible sous 2P-LSM 19. L'utilisation d'un journaliste endogène fluorescent tel que les splénocytes ubiquitine-GFP (figure 2, Vidéos supplémentaires 1 et 2), on peut suivre ces migrations lymphocytes et les comportements pour les jours jusqu'à une semaine dans des conditions non-stimulation des conditions physiologiques. Avec des détecteurs multicanaux à haute sensibilité, il est possible d'acquérir un ensemble de données d'imagerie multiplex qui englobe l'information structurelle ainsi que la dynamique d'interaction entre les multiples partenaires cellulaires 17,19. Lorsque les techniques chirurgicales sont correctement exécutées et les conditions environnementales soigneusement contrôlée, lymtes doit présenter la vitesse de migration caractéristique, comme le montre la figure 2c, 2d et ailleurs 13-14,16. Les lymphocytes peuvent également présenter des différences dans la vitesse de migration en fonction des sous-régions de l'imagerie LN objet, points de repère afin supplémentaires telles que les vaisseaux sanguins (comme l'a souligné par l'introduction de colorants navires) vous aidera à déterminer la qualité d'image globale (à savoir le contrôle de température appropriée , un traumatisme minime à LN, etc) 3,6,20. Figure 1. Construction d'un titulaire de la souris pour souris poplitée Imaging LN a) Schéma de montage porte-souris;. B) la préparation de la souris Représentant intravitale; c) Assemblée Terminé porte-souris; d) gros plans de la LN poplitée après l'exposition chirurgicale. Figure 2. L'analyse des migrations de GFP + lymphocytesdans la LN poplitée. (a) aperçu 3D prises de la séquence d'imagerie 2P-LSM de l'LN poplitée dans une souris receveuse C57BL / 6 adoptive transféré avec 1×10 7 lymphocytes + 1 jour avant la GFP à l'imagerie. Ligne Dash désigne la frontière des follicules de cellules B; (b) Titres de la migration des lymphocytes au cours de 1 heure de l'imagerie en continu; c) Distribution de la vitesse de migration globale des lymphocytes. Vitesse moyenne = 10,04 ± 4,26 um / min (total de 15,125 pistes analysées), d) Différentiel distribution cellulaire vitesse de migration des cellules présentes dans le follicule des cellules B (open bars; la vitesse moyenne = 8,79 ± 3,90 um / min; total 1.525 pistes analysées ) et des lymphocytes T zone (barres fermées; la vitesse moyenne = 13,77 ± 5,93 um / min; total de 1.250 titres analysés). Échelle = 50 microns. Vidéo supplémentaire 1. Time-lapse intravitale 2P-LSM imagerie d'un LN souris poplitée comme décrit dans la figure 2. Un total de 1×10 7 lymphocytes ont été isolés enom une souris ubiquitine-GFP + et des bailleurs de fonds transférés par voie intraveineuse adoptive dans une souris receveuse C57BL / 6 24 heures avant l'imagerie. Une série de xy (750 mm x 750 um) des images en fluorescence ont été prises par le biais fixe z piles (5 étapes um, 13 étapes) pour obtenir une pile XYZ Imaging (750 mm x 750 mm x 65 um), qui a été répétée toutes les 20 secondes pour un total de 60 minutes, ce qui entraîne une séquence d'imagerie pour l'analyse xyzt vitesse (figures 2c, 2d). La vitesse de lecture = 450x. Échelle = 50 microns. Horodatage = min: sec. Cliquez ici pour visionner la vidéo supplémentaire . Vidéo supplémentaire 2 zoom-en vue de la séquence d'imagerie en vidéo supplémentaire 1 au niveau du follicule des cellules B -. Frontière T zone de cellule. La vitesse de lecture = 450x. Échelle = 25 um. Horodatage = min: sec. Clécher ici pour visionner la vidéo supplémentaire.