Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية
Summary
وقد مكنت التطورات الحديثة في 2-الفوتون المجهري في الوقت الحقيقي<em> في</em> تصوير الوضع الطبيعي للأنسجة الحية في النماذج الحيوانية، وبالتالي تعزيز قدرتنا على التحقيق في سلوك الخلوية في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. هنا، نحن الخطوط العريضة الاستعدادات اللازمة لأداء التصوير intravital من العقدة اللمفية المأبضية الماوس.
Abstract
الغدد الليمفاوية (LNS) هي الأجهزة اللمفاوية الثانوية، والتي تحتل موقعا استراتيجيا في جميع أنحاء الجسم للسماح لمحاصرة وعرض المستضدات الأجنبية من الأنسجة الطرفية لرئيس الوزراء واستجابة جهاز المناعة على التكيف. جنبا إلى جنب بين الاستجابات المناعية الفطرية وقابلة للتكيف، وLN هو موقع مثالي لدراسة التفاعلات المناعية 1،2 الخلية. الخلايا الليمفاوية (خلايا T والخلايا B والخلايا القاتلة الطبيعية)، والخلايا الجذعية (DCS)، والضامة تشكل الجزء الأكبر من نخاع العظام المستمدة من العناصر الخلوية من LN. ويحتل موقعا استراتيجيا هذه الخلايا في LN للسماح للمراقبة الفعالة للمستضدات الذات ومستضدات الأجانب المحتملين 3-5. وهذه العملية التي واجهت بنجاح مستضدات الخلايا الليمفاوية وما شابه ذلك هو موضوع تحقيق مكثف في السنوات الأخيرة، وينطوي على تكامل الاتصالات الجزيئي بما في ذلك مستقبلات المستضد، جزيئات الالتصاق، كيموكينات، وهياكل اللحمية مثل شبكة الليفي شبكي 2،6-12 . </p>
قبل وضع من فلوري في الوقت الحقيقي وعالية الدقة في التصوير الحي، والمحققين اعتمدوا على التصوير الثابت، الذي لا يقدم سوى الأجوبة المتعلقة التشكل، موقف، والهندسة المعمارية. في حين أن هذه الأسئلة أساسية في فهمنا لسلوك الخلايا المناعية، والقيود الذاتية مع هذه التقنية لا تسمح تحليل للاتجار اللمفاويات فك خيوط والبيئية التي تؤثر على سلوك الخلية الحيوية. في الآونة الأخيرة، وتطوير intravital اثنين من الفوتون سمح ليزر المسح المجهري (2P-LSM) المحققين لعرض حركات ديناميكية وتفاعلات الخلايا الفردية ضمن LNS حية في الموقع 12-16. على وجه الخصوص، وقد طبقت نحن وغيرنا هذا الأسلوب لسلوك صورة الخلوية والتفاعلات داخل LN المأبضية، حيث شكله المدمج، والطبيعة كثيفة توفر ميزة الحصول على بيانات متعددة على مساحة والنسيج واسعة مع الهياكل الفرعية الأنسجة المختلفة 11،17-18 . هذا أنامن المهم أن نلاحظ أن هذه التقنية توفر فوائد إضافية على explanted تقنيات التصوير الأنسجة، والتي تتطلب انقطاع الدم، وتدفق الليمفاوية، وفي نهاية المطاف ديناميات الخلوية للنظام. بالإضافة إلى ذلك، الأنسجة explanted لها نافذة محدودة للغاية من الوقت الذي لا تزال قابلة للحياة الأنسجة للتصوير بعد ازدراع. مع الترطيب المناسب ورصد أحوال الحيوان البيئية، يمكن تمديد الوقت التصوير بشكل ملحوظ مع هذه التقنية intravital. هنا، نقدم طريقة مفصلة لإعداد الماوس المأبضية LN لغرض أداء التصوير intravital.
Protocol
Discussion
وقد صاحبت التطورات الحديثة في ذات الدقة العالية في تقنيات التصوير في الموقع، خصوصا 2P-LSM، من خلال الاهتمام المتزايد في دراسة سلوك الخلوية الحيوية في الجسم الحي. تقنية التصوير 4D على LN المأبضية على فأرة الحاسوب حية تسمح مثل هذه التحليلات في السلوك الديناميكي من الخلايا المناعية داخل النسيج undisrupted الصغرى البيئة. استخدام LSM-2P مع كاشفات متعددة تغطي كامل الطيف المرئي يسمح في وقت واحد لجمع البيانات والتصوير من السكان الخلية متعددة. ويمكن الآن يمكن تحقيق ذلك من خلال استخدام الخلايا في الجسم الحي محددة الفئران مراسل فلوري (على سبيل المثال، Ubiquitin eGFP، طلب تقديم العروض، أو eCFP-) جنبا إلى جنب مع الاستفادة من نقل بالتبني من سكان الخلية المسمى تفاضلي باستخدام الأصباغ العضوية خلية فلوري (على سبيل المثال CFSE ، SNARF-1، وخلية المقتفي أورانج) لبحث الآليات الخلوية وظيفة داخل LN. بالإضافة إلى الملاحظة المباشرة للتفاعلات بين ج تتبع تفاضليالسكان الذراع، لا يمكن للبيانات التصوير المتعدد الخضوع لمزيد من التحليل المتاحة تجاريا مع برامج التصوير برامج معالجة (على سبيل المثال Imaris، BitPlane شركة) لتوضيح مزيد من سلوك الخلايا وظيفة. مجموعة واسعة من الاحتمالات موجودة لدراسة آليات التفاعل الخلوية باستخدام هذه في الجسم الحي، وعلى تقنيات السيليكو.
القيد الرئيسي من المنهج التجريبي وصفها هنا هو التعقيد التقني الكامنة في نهج عملية جراحية. هذا الأسلوب يتطلب تدريب صارم لتصبح مألوفة مع تشريح ذات الصلة، والإجراءات الدقيقة والمهارات الفنية كما هو مطلوب بموجب هذا البروتوكول. العوامل يزيد من تعقيد وتشمل صعوبة في الحد من تلف الأنسجة أثناء التنقيب LN، وتحسين الاستقرار الأنسجة أثناء التصوير، ومنع الإصابة الحرارية والليزر إلى LN قبل وأثناء تجريب التصوير. واضطراب في أي من هذه العوامل تؤدي إلى أقل من المستوى الأمثل الليمفاويةوالحركة ocyte وبالتالي التدخل مع التفسير الصحيح لتحليل البيانات الناتجة التصوير.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من لجنة التحقيق الوطنية 1R01CA154656، NIAID 1R21AI092299، معهد بحوث السرطان، مؤسسة سانت Baldrick، ومؤسسة دانا، مؤسسة غابرييل في الملاك، وهيونداي موتورز الأمريكية "الأمل على اساس عجلات" البرنامج.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number |
| Isoflurane, USP | Baxter Healthcare Corporation | NDC 10019-773-60 |
| Vetbond | 3M | 1469SB |
| Nair – hair removal lotion | Nair | |
| PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV |
| Heating pad | Watlow | |
| Heating Pad Controller | Watlow | |
| Air and O2 | Airgas | |
| Temperature probe | Harvard Apparatus | |
| Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc | 14101 |
| Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc | 14141 |
| Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5880 |
| Cover of 100×20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 |
| Cover of 100×20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 |
| Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products, L.P. | NDC 67618-150-08 |
References
- Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
- Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
- Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
- Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
- Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
- Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
- Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
- Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
- Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
- Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
- Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
- Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
- Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
- Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).
