胎児性アルコール暴露のゼブラフィッシュモデルの催奇形性変化を評価する

1。胚のエタノール処理野生型の交配から派生したゼブラフィッシュ胚は、28で発生した胚を5mlの水に°C。 （ミリQ 60 mg / Lのインスタントオーシャン水）。野生型胚の異なる株は、エタノール曝露9にわずかに異なる許容範囲を持っています。 エタノールへの暴露は、最大24時間パルスは、時間の所望の長さのドームステージ（〜4.3時間後に受精、HPF）で開始されました。この開始段階では、原腸陥入直前に、哺乳類の胚の着床段階とほぼ同等です。エタノール濃度は0.2％-2.5％、体積/体積の範囲を使用していました。テストでは、水溶液の25-50％の間で発生中の胚10、11で終わることを明らかにした。胚は、時間の希望の長さは28℃で維持されます。エタノール暴露の希望の長さの後、エタノール – 水溶液を除去し、交換し、通常のゼブラフィッシュの水で3回洗浄をし、foを維持されている時間のrは希望の長さ。欠陥の特異性は、発症、用量、およびエタノールのパルスの長さの時間に依存します。 2。 in situハイブリダイゼーション、抗体、および軟骨染色で RNAの胚の収集、 定量PCRのmRNAを収集するには、時代にマッチした胚をエッペンドルフチュー​​ブに回収されています。ゼブラフィッシュの水を除去した後、TCEPとの溶解バッファが追加されます。電動粉砕機は、物理的に溶解液で胚を解離するために使用されます。これは、任意の非解離大部分を削除します事前に明確にする列を介して渡されます。得られた溶液は、溶解プロセスによってリリースされたすべての高分子を含んでいます。 RNAは、その後の洗浄とDNase処理に続いて、列にこのソリューションを実行することによって抽出されます。溶出後、水またはメーカー（5'-内閣）によって提供される溶出液のいずれかを使用して実行されます。 RNAは、マイクロでは定量PCRのために標準的な技術を用いてcDNAに変換したり使用することができますアレイ解析。 in situハイブリダイゼーション、抗体染色、6日から24日胚でのために、HPF、4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒドで固定したこれは一緒に付着胚を保つために、PBS + 0.1％ツイーン（PBT）で3回洗浄し、続いています。胚はその後メタノール3シリーズを介して転送されています。PBTは、それらが-20℃で保存することができた時点で、100％メタノールに洗うこれらの胚はin situハイブリダイゼーションまたは抗体染色に使用することができます。いくつかの抗体は、メタノール処理後に動作しないので、この警告を考慮する必要があり、特定の抗体は、それがメタノール処理後に動作するかどうかを判断するためにテストされています。 軟骨染色のために、胚は5〜6日後に受精（DPF）を発生させる必要があります。彼らはその後4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド中で固定されています°Cは、PBTで3回洗浄した。 3。エタノールによって誘発される遺伝子発現の変化と発達の影響を評価する<li>遺伝子の発現レベルが変更されているかどうかを確認するには、標的遺伝子が両方の定量PCRにより、in situハイブリダイゼーションで調べられます。定量PCRは、その後3つの別々の生体試料を使用して検証、統合されたDNAテクノロジー（IDT）ソフトウェアを使用して設計したプライマーを用いて達成される。一度プライマーが検証されているが、定量PCRは、収集のRNAサンプルから作成されたcDNAで実行されます。各サンプルは三重で実行されます。 PCR反応は、多色検出システムでクロマ-4 PCR装置（BioRad社）または同様のPCRマシン上にプラチナのSYBR Green定量PCRスーパーミックス（Invitrogen）を実行されます。尋問されている遺伝子に加えて、プライマーのセットコントロールは、cDNAまたはRNA調製のわずかな違いのバランスをとるために使用されていることが重要です。私たちのゼブラフィッシュ胚では、私たちはGAPDHを使用します 。5'GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3 'と5'TTGCACCACCCTTAATGTGA3'。分析された遺伝子は、遺伝子発現の相対定量が2日にPfafflメソッドのバリエーションを用いて計算されるGAPDHのレベルに正規化されている<sup> – CT、野生型は12〜実験的な相対的に倍の差などのデータが表示されます。通常の計算では、すべての遺伝子はすべてのサイクルのために二度のDNAを複製していることを前提とし、したがって、整数値 "2"以上の電力計算として表される、リファレンス遺伝子の変化に対する実験的な遺伝子の変化の割合としてデータを表現するこれは完璧なPCR反応に見られるサイクルごとにDNAの二倍の効率です。 Pfaffl方法は、選択されたPCRプライマーのために真の効率を生成する実験で一般的な "2"に置き換えられます。これは、PCR反応の違いがより正確な反射を反映しています。完全な式は次のとおりです。 （実験的な遺伝子の効率（） 処理サンプルのコントロールのCtサンプル-CT） ————————————————– ———————————– （リファレンス遺伝子の効率化）（Ctのコントロールサンプル-処理した試料のCt） in situハイブリダイゼーションのために、ジゴキシゲニン（DIG）で標識したリボプローブは、目的の遺伝子の一部を含むプラスミドから構築されています。年齢をマッチさせた胚は、標準的な条件13を用いてリボプローブにさらされると色反応（NBT / BCIP）を用いて標識リボプローブの位置を可能にするアルカリホスファターゼに結合した抗DIG抗体を用いて検出されます。胚はその後ライカ実体顕微鏡（ 図1B-G）を使用して可視化されています。 形態形成の開発を評価するために、胚を希望する時に収集し、解剖顕微鏡下で検査されています。体節形状のため、ライブ胚は14を結像される。間の眼の距離とボディの長さについては、胚がPFAで固定されています。すべてのケースにおいて、所望の領域の画像はAdobe Photoshopのディストリを使用して、固定倍率で解剖顕微鏡でキャプチャされ、測定値が取られ電子10,14。 幼虫のゼブラフィッシュで開発し、軟骨の構造に治療の効果を調べるために、我々はアルシアンブルー染色を使用しています。数時間または一晩20％の氷酢酸（酸アルコール）：固定ゼブラフィッシュの幼虫は、80％エタノールに溶解し、アルシアンブルー溶液で処理されています。幼虫は、1％KOHに転送される前に、酸アルコールの数回の洗浄で脱色されています。色素細胞のさらなるクリアするための3％過酸化水素溶液。ゼブラフィッシュは、軟骨の構造を表示するには少なくとも4日齢である必要があり、これらはよりよい5または6日間の古い魚で定義されています。 生きている胚における細胞死は、アクリジンオレンジ（AO）を用いて評価されています。 AOは生きている細胞への透過性細胞ではなく、アポトーシスとネクローシスを受けているものも含めて妥協膜を持つ細胞内でDNAに結合する。生きている胚をPBSで3回洗浄し、続いて1時間PBS中で5 mg / mlのAOとインキュベートされています。胚はその後、共焦点顕微鏡を用いて画像化されています。デジタルZ-SERIES画像はコンポジットを作成するために結合されています。 4。ゼブラフィッシュ胚を操作するエタノール曝露によって減少している遺伝子を同定した後、それが不足している遺伝子を置き換えるために設計されたmRNAの注入を使用してそれらを交換しようとすることが可能です。キャップmRNAは、メーカーの指示（mMessage機、Applied Biosystems社）によると、in vitro転写キットに RNAポリメラーゼを用いて直鎖状DNAプラスミドから転写されています。 25から200の間でのRNAのPG / NLが0.1 M KClの溶液に、1〜2細胞期のゼブラフィッシュの卵に注入される。胚はその後（ 図5）上記のようにエタノールで処理される前に回復するために許可されています。 エタノール曝露によって増加している任意の遺伝子転写物のために、彼らは "ノックダウン"アンチセンスモルフォの技術を用いて還元するか、することができます。アンチmorpholinos（アモス）企業遺伝子ツールによって設計されており、蛋白質にRNAの翻訳をブロックするか、またはBLO実験的な必要性に応じて、CK RNAの成熟化とスプライシング、。 morpholinosのこのアクションは、標的遺伝子、それらが使用可能な場合anitibodiesを用いて測定することができるの赤字のために活性タンパク質の量を制限します。 RNAスプライシングmorpholinosの効率は、スプライスおよびスプライス転写産物の相対量を検出するためにRT-PCRを用いて測定することができる。モルホリノで滴定すると、用量依存性の活性が15になる可能性があります。アモスはDanieau溶液中での作業濃度（ng濃度になるようにPGを滴定）（58のNaCl、0.7 mMの塩化カリウム、0.4mMのMgSO 4を 、0.6 mMのカルシウム（NO 3）2、5mMのHEPES、pH7.6）で希釈する。注射は、胚は上記のようにエタノール処理に供される前に開発が許可されている、1から2細胞期で行われます。 5。代表的な結果に関連して発達と遺伝的欠陥の数のエタノール結果にゼブラフィッシュ胚の暴露表現型は他の脊椎動物で見つかった。我々は脊索（データは14を図示せず）を含む、軸組織の異常な開発を文書化しています。エタノールによって生成された発達の遅れは明らかに短縮し、時折中断脊索（データは14を図示せず）につながる、適切な脊索の伸長の中断につながります。おそらく、この初期遅延と脊索欠陥が未処理の対照に見られるように彼らの強い山形の形状を失った体節の後の異常（ 図2）に部分的につながり、見ての表現型の特徴的なU字型の体節に近いソニックシグナリングが14減少します。体節の角度は、標準的なソフトウェア、および92.1から±4.6°の未処理のコントロールの122.6まで±6.6℃のエタノール処理した胚（P <0.001）の角度の増加を用いて測定することができる。 downstreaかもしれないエタノール暴露の別の結果初期の発育遅延と後で脊索欠陥のmは、胚の短縮長さ（ 図3）です。でも、胚が考慮エタノール曝露によって生成された曲率を取るために測定し、エタノール曝露が胚（ 図3E 14）にさらされていたエタノールの用量に依存している短縮トランクにつながります。この知見は、ゼブラフィッシュのモデルは人間の先天性欠損症の理解に関連していることを示唆し、開発16、17時のエタノールにさらされる子どもたちに見られる思春期前の時期低身長の持続性に似ています。 FASの古典的な特徴の一つは、還元顎、小さなアイ開口し、スムーズな媚薬を含む古典的な相である。これらの機能の多くは正中線の組織の減少に関連しています。それは、重度のエタノール曝露はsynopthalmiaと単眼症を含む、さらに顕著な表現型につながることを動物モデルで実証されている。時博覧会エタノールの増加用量のゼブラフィッシュ胚を歌って、眼の距離（IOD）は、ヒトの出生欠陥の性質と一致する（ 図4）用量依存的に減少します。単眼症は、非常に高用量で発見されていますが、低用量では、この動物モデルは正中線顔面開発10で同様の欠陥があることを示唆し、IOD（ 図4）の大幅な削減を生成しません。 エタノール曝露によって生成されたボディと顔の両方に欠陥が根底にあるメカニズムを理解するために、我々は開発の初期段階で起こる遺伝子発現の変化を確立しようと合理的に後に発達障害に寄与することが期待されるかもしれない。我々は二つの方法でこれを行うには、胚からmRNAの抽出は、コントロール（ 図1A）に比べてエタノール処理した胚の遺伝子発現レベルの定量的評価が可能になります。さらに、in situで行うことができますかかわらず（ 図1B-G 18）信号が減少されているかどうかの遺伝子のパターンを見てハイブリダイゼーション。この例では、その発現がエタノールへの暴露後に減少される2つの遺伝子は、GLI1とsix3bが示されている。我々はsix3bのためにその場のパターンで調べたとき、我々は、エタノールにさらされる胚におけるこの遺伝子の発現の空間的広がり（ 図1 EG）の減少を発見した。同様の減少は、遺伝子GSC（ 図BD）で発見された。 six3bとGSCの両方が頭蓋顔面の正中線の組織に貢献して運命の組織で発現されています。したがって、8 HPFにおけるこれらの遺伝子の減少は、 図4に示すように、後で見つかったIODの減少と一致している。 エタノールの影響を受けている遺伝子が同定されれば、それらの発現が増加または減少することのできるメカニズムがあります。この特定のエクサでmple、我々は、定量PCRによって減少された2遺伝子（GLI1とsix3b）が示されている。我々は、これらの遺伝子の変化を逆にすると、成果を向上させることができるかどうかを判断するためにmRNAを注入することにしました。この実験では、代わりにGLI1を注入することにより、我々は、SHH、GLI1レベルを増加させる配位子を注入することにしました。 six3bのために、私たちはsix3b自体を注入することができました。我々はsix3bを注入したときに変更が見つかりません（データは示さず）が、根本的に補足SHH注入（ 図5）とゼブラフィッシュ胚の総欠陥を救出することができました。 図1エタノールの暴露は、早期のパターンと選択された発生遺伝子の遺伝子発現レベルを変更します。 8hpfにおける胚のA）定量PCRの結果。二つの遺伝子の結果が表示されます。six3bとGLI1を 。 3つの独立した実験の平均値として示された結果、と示されるエタノールの投与量は2.5％です。両方の遺伝子がコントロールから（t-検定、p <0.05）が有意である方法で削減されます。 8 HPFのゼブラフィッシュ胚のin situハイブリダイゼーション BG）。 GSCとsix3b両方のパターンは、コントロールと比較して、この時点で変更されます。 （Loucks らから許可を得て修正しました。2007）。 図2体節の開発が処理された胚で変更されます。体節構造との角度は48 HPFで検査されています。コントロールの胚（）では、体節は、シェブロンの形状や鋭角を持っています。エタノール露出したゼブラフィッシュでは、より多くのIまたはU字型の体節、あまり鋭い角度を持っています。 （LoucksとAhlgren、2009年から許可を得て変更された）。 図3エタノール処理が大幅にゼブラフィッシュの体の長さを減少させます。未処理およびエタノール曝露胚の長さは5日postfertilizationで測定した。長さの有意な減少は、すべて処理された胚（ANOVA、P <0.001）が認められた。 BD。大きな減少が2.0％と2.5％のエタノールを投与した胚で見られたのに対し、1.0％と1.5％のエタノールで処理した胚の長さの合計がわずかにあるが有意な減少があった。各クラッチのサイズの違いを制御するために、E.、各実験のコントロール胚は100に正規化し、兄弟処理胚は100のパーセンテージとして表した。 （LoucksとAhlgren、2009年から許可を得て変更された）。 ゼブラフィッシュ胚における眼の距離（IOD）の減少を図4エタノール曝露の結果。 A）胚の正面ビューには、通常の溶融目の表現型を示しています。 B）エタノールの異なる投与量は原腸陥入のresの間に3時間投与魚は24時間後に検査されたときにultsはIOD減少した。溶融目や単眼症は、（2.4％）試験した最高用量で見られます。 *は、コントロールと比較してIODの有意な減少を示しています。 （Ahlgren、2004年から許可を得て変更された）。 図5。SHH-N mRNAの注入は、ゼブラフィッシュのエタノール曝露によって生成された総欠陥を救助する。 One-2細胞期胚を注入した胚のが100 pg / NL SHH-NのmRNAの半分を注入した4.3から24 HPFからの標準的なエタノールの用量に暴露した。胚は5 DPFで分析した。 2.0％エタノールで処理した胚では、単眼症を含む背側に湾曲し、短い尾、I字型体節、眼の欠陥を示す。これらの表現型のレスキューを注入した胚の76分の71（93％）で見られます。これらの胚で、体はまっすぐに、体節は、シェブロンの形ですし、目が完全に分離されています。