Вскрытие и культуры мышь дофаминергической и стриатуме эксплантов в трехмерных Анализы коллагеновой матрице
Summary
Эксплантов из системы мозга дофамина и стриатуме используются в анализе коллагеновой матрицы для<em> В пробирке</em> Анализ mesostriatal и striatonigral путь развития. В данном анализе аксонального результат и рекомендации можно манипулировать и количественно. Она также может быть модифицирован для оценки других регионов или молекулярных сигналов.
Abstract
Мозге дофамина (mdDA) нейронов проект по медиальной пучка переднего мозга на несколько областей, в конечном мозге, в том числе стриатуме 1. Взаимно, средних колючих нейронов в полосатом теле, которые приводят к striatonigral (прямой) путь иннервируют черной субстанции 2. Развитие этих аксонов путей зависит от комбинаторного действия множества роста аксонов и руководство в том числе сигналы молекул, которые выпущены невриты или (промежуточные) целевые регионы 3,4. Эти растворимые факторы могут быть изучены в лабораторных на mdDA культивирования и / или полосатой эксплантов в коллагеновой матрицы, которая обеспечивает трехмерную подложку для аксонов имитируя внеклеточной среде. Кроме того, коллагеновые матрицы позволяет формирование относительно стабильного градиенты белков выпущен других эксплантов или клетки помещаются в непосредственной близости (см., например, ссылки 5 и 6). Здесь мы опишем методы PURкации крысы хвост коллагена, микродиссекции дофаминергической и полосатой эксплантов, их культуры в коллаген гели и последующего иммуногистохимического и количественного анализа. Во-первых, мозг эмбриона мыши E14.5 изолированы и дофаминергической и полосатой эксплантов которые микродиссекции. Эти эксплантов затем (со) культивировали в коллагеновых гелей на покровные 48 до 72 часов в лабораторных условиях. Впоследствии аксонального проекции визуализируется использованием нейронных маркеров (например, тирозин гидроксилазы, DARPP32 или βIII тубулина) и рост аксонов и притяжения или отталкивания ответы аксона количественно. Это нейронов подготовки является полезным инструментом для лабораторного исследования клеточных и молекулярных механизмов mesostriatal и striatonigral рост аксонов и руководства в процессе разработки. С помощью этого анализа, можно также оценить другие (промежуточные) цели дофаминергической и полосатой аксонов или для проверки специфических молекулярных сигналов.
Protocol
Discussion
Анализ коллагеновой матрицы, описанные здесь были использованы и улучшены различные лаборатории в последние десятилетия, чтобы исследовать различные аксона руководством молекул и нейронных систем (например, см. ссылки 5-8). Эти исследования показали, что этот анализ является мощным ин?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Анализ коллагеновой матрицы была разработана и улучшена работа различных исследовательских групп в течение последних двух-трех десятилетий. Подходов, описанных здесь, дофаминергических и полосатой эксплантов большую пользу от этих исследований. Кроме того, авторы хотели бы поблагодарить Asheeta Прасад за помощь в создании полосатого культурами эксплантов. Работа в лаборатории была профинансирована по правам границы Научная программа организации (премия развития карьеры), Нидерландская организация по научным исследованиям и развитию (ZonMw-VIDI и ZonMw-TOP), Europanian союза (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , грант 222 999) (для RJP) и Нидерландская организация по научным исследованиям (TopTalent, в ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
